Imunomodulatorni metaboliti ključna su značajka tumorskog mikrookruženja (TME), ali uz nekoliko iznimaka, njihov identitet ostaje uglavnom nepoznat. Ovdje smo analizirali tumore i T-stanice iz tumora i ascitesa pacijenata s visokogradusnim seroznim karcinomom (HGSC) kako bismo otkrili metabolom ovih različitih TME odjeljaka. Ascites i tumorske stanice imaju velike razlike u metabolitima. U usporedbi s ascitesom, tumor-infiltrirajuće T-stanice značajno su obogaćene 1-metilnikotinamidom (MNA). Iako je razina MNA u T-stanicama povišena, ekspresija nikotinamid N-metiltransferaze (enzima koji katalizira prijenos metilnih skupina s S-adenozilmetionina na nikotinamid) ograničena je na fibroblaste i tumorske stanice. Funkcionalno, MNA potiče T-stanice da luče citokin tumorske nekroze alfa koji potiče rast tumora. Stoga, MNA izveden iz TME doprinosi imunoregulaciji T-stanica i predstavlja potencijalnu imunoterapijsku metu za liječenje raka kod ljudi.
Metaboliti izvedeni iz tumora mogu imati snažan inhibitorni učinak na antitumorski imunitet, a sve više dokaza pokazuje da mogu poslužiti i kao ključna pokretačka snaga za napredovanje bolesti (1). Uz Warburgov efekt, nedavni radovi su započeli karakterizirati metaboličko stanje tumorskih stanica i njegov odnos s imunološkim stanjem tumorskog mikrookruženja (TME). Studije na mišjim modelima i ljudskim T stanicama pokazale su da metabolizam glutamina (2), oksidativni metabolizam (3) i metabolizam glukoze (4) mogu neovisno djelovati na različite podskupine imunoloških stanica. Nekoliko metabolita u tim putovima inhibira antitumorsku funkciju T stanica. Dokazano je da blokada koenzima tetrahidrobiopterina (BH4) može oštetiti proliferaciju T stanica, a povećanje BH4 u tijelu može pojačati antitumorski imunološki odgovor posredovan CD4 i CD8. Osim toga, imunosupresivni učinak kinurenina može se spasiti primjenom BH4 (5). U glioblastomu s izocitrat dehidrogenazom (IDH), lučenje enantiometaboličkog (R)-2-hidroksiglutarata (R-2-HG) inhibira aktivaciju, proliferaciju i citolizu T-stanica (6). Nedavno je pokazano da metilglioksal, nusprodukt glikolize, proizvode supresorske stanice mijeloidnog podrijetla, a prijenos metilglioksala u T-stanice može inhibirati funkciju efektorskih T-stanica. U liječenju, neutralizacija metilglioksala može prevladati aktivnost supresorskih stanica izvedenih iz mijeloida (MDSC) i sinergistički poboljšati terapiju blokade kontrolnih točaka u mišjim modelima (7). Ove studije zajednički naglašavaju ključnu ulogu metabolita izvedenih iz TME u regulaciji funkcije i aktivnosti T-stanica.
Disfunkcija T-stanica široko je zabilježena kod raka jajnika (8). To je dijelom posljedica metaboličkih karakteristika svojstvenih hipoksiji i abnormalnoj vaskulaturi tumora (9), što rezultira pretvorbom glukoze i triptofana u nusprodukte poput mliječne kiseline i kinurenina. Prekomjerni izvanstanični laktat smanjuje proizvodnju interferona-γ (IFN-γ) i potiče diferencijaciju mijelosupresivnih podskupina (10, 11). Konzumacija triptofana izravno inhibira proliferaciju T-stanica i inhibira signalizaciju receptora T-stanica (12-14). Unatoč tim zapažanjima, mnogo istraživanja vezanih uz imunološki metabolizam provedeno je u in vitro kulturi T-stanica korištenjem optimiziranih medija ili ograničeno na homologne mišje modele in vivo, od kojih nijedno ne odražava u potpunosti heterogenost ljudskih karcinoma i fiziološkog makro i mikro okruženja.
Uobičajena značajka raka jajnika je peritonealno širenje i pojava ascitesa. Nakupljanje stanične tekućine u ascitesu povezano je s uznapredovalom bolešću i lošom prognozom (15). Prema izvješćima, ovaj jedinstveni odjeljak je hipoksičan, ima visoke razine faktora rasta vaskularnog endotela (VEGF) i indolamin 2,3-dioksigenaze (IDO) te je infiltriran T regulatornim stanicama i mijeloidnim inhibitornim stanicama (15-18). Metaboličko okruženje ascitesa može se razlikovati od samog tumora, pa reprogramiranje T stanica u peritonealnom prostoru nije jasno. Osim toga, ključne razlike i heterogenost između ascitesa i metabolita prisutnih u tumorskom okruženju mogu ometati infiltraciju imunoloških stanica i njihovu funkciju na tumorima te su potrebna daljnja istraživanja.
Kako bismo riješili ove probleme, osmislili smo osjetljivu metodu separacije stanica i tekućinske kromatografije s tandemskom masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) za proučavanje različitih tipova stanica (uključujući CD4+ i CD8+ T stanice), kao i unutar i između tumora. Njegovi metaboliti protežu se kroz stanice u istom ascitesu i tumorskom okruženju pacijenta. Ovu metodu koristimo u kombinaciji s visokodimenzionalnom protočnom citometrijom i sekvenciranjem RNA pojedinačnih stanica (scRNA-seq) kako bismo pružili visoko razlučivi portret metaboličkog statusa ovih ključnih populacija. Ova metoda otkrila je značajno povećanje razine 1-metilnikotinamida (MNA) u tumorskim T stanicama, a in vitro eksperimenti pokazali su da imunomodulatorni učinak MNA na funkciju T stanica prije nije bio poznat. Općenito, ova metoda otkriva međusobne metaboličke interakcije između tumora i imunoloških stanica te pruža jedinstven uvid u metabolite imunološke regulacije, što može biti korisno za liječenje imunoterapije raka jajnika temeljene na T stanicama. Mogućnosti liječenja.
Koristili smo visokodimenzionalnu protočnu citometriju kako bismo istovremeno kvantificirali unos glukoze [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglukoza (2-NBDG) i mitohondrijska aktivnost [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) su tipični markeri koji razlikuju imunološke stanice i populacije tumorskih stanica (Tablica S2 i Slika S1A). Ova analiza pokazala je da u usporedbi s T stanicama, ascites i tumorske stanice imaju veće razine unosa glukoze, ali imaju manje razlike u mitohondrijskoj aktivnosti. Prosječni unos glukoze tumorskim stanicama [CD45-EpCAM (EpCAM)+] je tri do četiri puta veći od T stanica, a prosječni unos glukoze CD4+ T stanica je 1,2 puta veći od CD8+ T stanica, što ukazuje na to da tumor infiltrirajući limfociti (TIL) imaju različite metaboličke potrebe čak i u istom TME (Slika 1A). Nasuprot tome, mitohondrijska aktivnost u tumorskim stanicama slična je onoj CD4+ T stanica, a mitohondrijska aktivnost obje vrste stanica veća je od aktivnosti CD8+ T stanica (Slika 1B). Općenito, ovi rezultati otkrivaju metaboličku razinu. Metabolička aktivnost tumorskih stanica veća je od aktivnosti CD4+ T stanica, a metabolička aktivnost CD4+ T stanica veća je od aktivnosti CD8+ T stanica. Unatoč tim učincima među vrstama stanica, ne postoji konzistentna razlika u metaboličkom statusu CD4+ i CD8+ T stanica ili njihovim relativnim udjelima u ascitesu u usporedbi s tumorima (Slika 1C). Nasuprot tome, u frakciji CD45-stanica, udio EpCAM+ stanica u tumoru povećao se u usporedbi s ascitesom (Slika 1D). Također smo uočili jasnu metaboličku razliku između EpCAM+ i EpCAM- staničnih komponenti. EpCAM+ (tumorske) stanice imaju veću apsorpciju glukoze i mitohondrijsku aktivnost od EpCAM- stanica, što je mnogo veće od metaboličke aktivnosti fibroblasta u tumorskim stanicama u TME (Slika 1, E i F).
(A i B) Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) unosa glukoze (2-NBDG) (A) i mitohondrijska aktivnost CD4+ T stanica (MitoTracker tamnocrvena) (B) Reprezentativni grafovi (lijevo) i tablični podaci (desno), CD8+ T stanice i EpCAM+ CD45-tumorske stanice iz ascitesa i tumora. (C) Omjer CD4+ i CD8+ stanica (CD3+ T stanica) u ascitesu i tumoru. (D) Udio EpCAM+ tumorskih stanica u ascitesu i tumoru (CD45−). (E i F) Unos glukoze EpCAM+ CD45-tumor i EpCAM-CD45-matriks (2-NBDG) (E) i mitohondrijska aktivnost (MitoTracker tamnocrvena) (F) reprezentativni grafovi (lijevo) i tablični podaci (desno) Ascites i tumorske stanice. (G) Reprezentativni grafovi ekspresije CD25, CD137 i PD1 protočnom citometrijom. (H i I) Ekspresija CD25, CD137 i PD1 na CD4+ T stanicama (H) i CD8+ T stanicama (I). (J i K) Naivni, centralno-memorijski (Tcm), efektorski (Teff) i efektorski memorijski (Tem) fenotipovi temeljeni na ekspresiji CCR7 i CD45RO. Reprezentativne slike (lijevo) i tablični podaci (desno) CD4+ T stanica (J) i CD8+ T stanica (K) u ascitesu i tumorima. P vrijednosti određene parnim t-testom (*P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001). Linija predstavlja usklađene pacijente (n = 6). FMO, fluorescencija minus jedan; MFI, srednji intenzitet fluorescencije.
Daljnja analiza otkrila je druge značajne razlike između fenotipskog statusa visoko razlučenih T stanica. Aktivirana (Slika 1, G do I) i efektorska memorija (Slika 1, J i K) u tumorima su mnogo češća od ascitesa (udio CD3+ T stanica). Slično tome, analiza fenotipa ekspresijom aktivacijskih markera (CD25 i CD137) i markera deplecije [protein programirane stanične smrti 1 (PD1)] pokazala je da iako su metaboličke karakteristike ovih populacija različite (Slika S1, B do E), nisu dosljedno uočene značajne metaboličke razlike između naivnih, efektorskih ili memorijskih podskupina (Slika S1, F do I). Ovi rezultati potvrđeni su korištenjem metoda strojnog učenja za automatsko dodjeljivanje staničnih fenotipova (21), što je dodatno otkrilo prisutnost velikog broja stanica koštane srži (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) u ascitesu pacijenta (Slika S2A). Među svim identificiranim tipovima stanica, ova populacija mijeloidnih stanica pokazala je najveću apsorpciju glukoze i mitohondrijsku aktivnost (Slika S2, B do G). Ovi rezultati ističu snažne metaboličke razlike između više tipova stanica pronađenih u ascitesu i tumorima kod pacijenata s HGSC-om.
Glavni izazov u razumijevanju metabonomskih karakteristika TIL-a je potreba izolacije uzoraka T stanica dovoljne čistoće, kvalitete i količine iz tumora. Nedavne studije pokazale su da metode sortiranja i obogaćivanja kuglicama temeljene na protočnoj citometriji mogu dovesti do promjena u profilima staničnih metabolita (22-24). Kako bismo prevladali ovaj problem, optimizirali smo metodu obogaćivanja kuglicama kako bismo izolirali i izolirali TIL iz kirurški reseciranog ljudskog raka jajnika prije analize LC-MS/MS (vidi Materijali i metode; Slika 2A). Kako bismo procijenili ukupni utjecaj ovog protokola na promjene metabolita, usporedili smo profile metabolita T stanica aktiviranih od strane zdravih donora nakon gore navedenog koraka odvajanja kuglica sa stanicama koje nisu odvojene kuglicama, već su ostale na ledu. Ova analiza kontrole kvalitete otkrila je da postoji visoka korelacija između ova dva uvjeta (r = 0,77), a tehnička ponovljivost skupine od 86 metabolita ima visoku ponovljivost (Slika 2B). Stoga ove metode mogu provesti točnu analizu metabolita u stanicama koje prolaze kroz obogaćivanje tipova stanica, pružajući tako prvu platformu visoke rezolucije za identifikaciju specifičnih metabolita u HGSC-u, omogućujući ljudima da steknu dublje razumijevanje specifičnosti stanica u programu seksualnog metabolizma.
(A) Shematski dijagram obogaćivanja magnetskim kuglicama. Prije analize LC-MS/MS-om, stanice će proći tri uzastopna kruga obogaćivanja magnetskim kuglicama ili ostati na ledu. (B) Utjecaj vrste obogaćivanja na količinu metabolita. Prosjek tri mjerenja za svaku vrstu obogaćivanja ± SE. Siva linija predstavlja odnos 1:1. Intra-klasna korelacija (ICC) ponovljenih mjerenja prikazana je u oznaci osi. NAD, nikotinamid adenin dinukleotid. (C) Shematski dijagram tijeka analize metabolita pacijenta. Ascites ili tumori se prikupljaju od pacijenata i krioprezerviraju. Mali dio svakog uzorka analiziran je protočnom citometrijom, dok su preostali uzorci prošli tri kruga obogaćivanja za CD4+, CD8+ i CD45- stanice. Ove stanične frakcije analizirane su LC-MS/MS-om. (D) Toplinska karta standardizirane količine metabolita. Dendrogram predstavlja Wardovo grupiranje euklidskih udaljenosti između uzoraka. (E) Analiza glavnih komponenti (PCA) mape metabolita uzorka, koja prikazuje tri ponavljanja svakog uzorka, uzorci istog pacijenta povezani su linijom. (F) PCA profila metabolita uzorka uvjetovanog pacijentom (tj. korištenjem djelomične redundancije); vrsta uzorka ograničena je konveksnom ovojnicom. PC1, glavna komponenta 1; PC2, glavna komponenta 2.
Zatim smo primijenili ovu metodu obogaćivanja kako bismo analizirali 99 metabolita u frakcijama CD4+, CD8+ i CD45-stanica u primarnom ascitesu i tumorima šest pacijenata s HGSC-om (Slika 2C, Slika S3A i Tablica S3 i S4). Populacija od interesa čini 2% do 70% izvornog velikog uzorka živih stanica, a udio stanica uvelike varira između pacijenata. Nakon odvajanja kuglica, obogaćena frakcija od interesa (CD4+, CD8+ ili CD45-) čini u prosjeku više od 85% svih živih stanica u uzorku. Ova metoda obogaćivanja omogućuje nam analizu populacija stanica iz metabolizma ljudskog tumorskog tkiva, što je nemoguće učiniti iz velikih uzoraka. Koristeći ovaj protokol, utvrdili smo da su l-kinurenin i adenozin, ova dva dobro karakterizirana imunosupresivna metabolita, povišeni u tumorskim T stanicama ili tumorskim stanicama (Slika S3, B i C). Stoga ovi rezultati pokazuju vjernost i sposobnost naše tehnologije odvajanja stanica i masene spektrometrije da pronađe biološki važne metabolite u tkivima pacijenata.
Naša analiza je također otkrila snažnu metaboličku separaciju tipova stanica unutar i između pacijenata (Slika 2D i Slika S4A). Posebno, u usporedbi s drugim pacijentima, pacijent 70 pokazao je različite metaboličke karakteristike (Slika 2E i Slika S4B), što ukazuje na to da može postojati značajna metabolička heterogenost između pacijenata. Vrijedi napomenuti da je u usporedbi s drugim pacijentima (1,2 do 2 litre; Tablica S1), ukupna količina ascitesa prikupljena kod pacijenta 70 (80 ml) bila manja. Kontrola heterogenosti među pacijentima tijekom analize glavnih komponenti (na primjer, korištenjem analize parcijalne redundancije) pokazuje konzistentne promjene između tipova stanica, a tipovi stanica i/ili mikrookruženje jasno su agregirani prema profilu metabolita (Slika 2F). Analiza pojedinačnih metabolita naglasila je ove učinke i otkrila značajne razlike između tipova stanica i mikrookruženja. Vrijedi napomenuti da je najekstremnija uočena razlika MNA, koja je obično obogaćena CD45- stanicama te CD4+ i CD8+ stanicama koje infiltriraju tumor (Slika 3A). Za CD4+ stanice, ovaj je učinak najočitiji, a čini se da je i MNA u CD8+ stanicama snažno pod utjecajem okoline. Međutim, to nije važno, jer se samo tri od šest pacijenata mogu procijeniti na CD8+ rezultate tumora. Osim MNA, u različitim vrstama stanica u ascitesu i tumorima, i drugi metaboliti koji su slabo karakterizirani u TIL-u također su različito bogati (slike S3 i S4). Stoga ovi podaci otkrivaju obećavajući skup imunomodulatornih metabolita za daljnja istraživanja.
(A) Normalizirani sadržaj MNA u CD4+, CD8+ i CD45- stanicama iz ascitesa i tumora. Okvirni dijagram prikazuje medijan (linija), interkvartilni raspon (okvirni zglob) i raspon podataka, do 1,5 puta veći od interkvartilnog raspona (okvirni brkovi). Kao što je opisano u Materijalima i metodama za pacijente, upotrijebite pacijentovu limma vrijednost za određivanje P vrijednosti (*P<0,05 i **P<0,01). (B) Shematski dijagram metabolizma MNA (60). Metaboliti: S-adenozil-1-metionin; SAH, S-adenozin-1-homocistein; NA, nikotinamid; MNA, 1-metilnikotinamid; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamid; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamid; NR, nikotinamid riboza; NMN, nikotinamid mononukleotid. Enzimi (zeleno): NNMT, nikotinamid N-metiltransferaza; SIRT, sirtuini; NAMPT, nikotinamid fosforibozil transferaza; AOX1, aldehid oksidaza 1; NRK, nikotinamid ribozid kinaza; NMNAT, nikotinamid mononukleotid adenilat transferaza; Pnp1, purinska nukleozid fosforilaza. (C) t-SNE scRNA-seq ascitesa (sivo) i tumora (crveno; n = 3 pacijenta). (D) Ekspresija NNMT u različitim staničnim populacijama identificiranim pomoću scRNA-seq. (E) Ekspresija NNMT i AOX1 u SK-OV-3, ljudskom embrionalnom bubregu (HEK) 293T, T stanicama i MNA-tretiranim T stanicama. Prikazana je presavijena ekspresija u odnosu na SK-OV-3. Prikazan je obrazac ekspresije sa SEM (n = 6 zdravih donora). Vrijednosti Ct veće od 35 smatraju se nedetektabilnim (UD). (F) Ekspresija SLC22A1 i SLC22A2 u SK-OV-3, HEK293T, T stanicama i T stanicama tretiranim s 8 mM MNA. Prikazana je presavijena ekspresija u odnosu na SK-OV-3. Prikazan je obrazac ekspresije sa SEM-om (n = 6 zdravih donora). Vrijednosti Ct veće od 35 smatraju se nedetektabilnima (UD). (G) Sadržaj staničnog MNA u aktiviranim zdravim donorskim T stanicama nakon 72 sata inkubacije s MNA. Prikazan je obrazac ekspresije sa SEM-om (n = 4 zdrava donora).
MNA se proizvodi prijenosom metilne skupine s S-adenozil-1-metionina (SAM) na nikotinamid (NA) pomoću nikotinamid N-metiltransferaze (NNMT; slika 3B). NNMT je prekomjerno eksprimiran u raznim ljudskim karcinomima i povezan je s proliferacijom, invazijom i metastazama (25-27). Kako bismo bolje razumjeli izvor MNA u T stanicama u TME-u, koristili smo scRNA-seq za karakterizaciju ekspresije NNMT-a u različitim tipovima stanica u ascitesu i tumorima tri pacijenta s HGSC-om (tablica S5). Analiza približno 6500 stanica pokazala je da je u ascitesu i tumorskom okruženju ekspresija NNMT-a ograničena na pretpostavljene populacije fibroblasta i tumorskih stanica (slika 3, C i D). Vrijedi napomenuti da ne postoji očita ekspresija NNMT-a ni u jednoj populaciji koja eksprimira PTPRC (CD45+) (slika 3D i slika S5A), što ukazuje na to da je MNA detektiran u spektru metabolita uveden u T stanice. Ekspresija aldehid oksidaze 1 (AOX1) pretvara MNA u 1-metil-2-piridon-5-karboksamid (2-PYR) ili 1-metil-4-piridon-5-karboksamid (4-PYR); slika 3B) također je ograničena na populaciju fibroblasta koji eksprimiraju COL1A1 (slika S5A), što zajedno ukazuje na to da T-stanice nemaju sposobnost konvencionalnog metabolizma MNA. Uzorak ekspresije ovih gena povezanih s MNA potvrđen je korištenjem drugog neovisnog skupa podataka o stanicama iz ascitesa pacijenata s HGSC-om (slika S5B; n = 6) (16). Osim toga, kvantitativna analiza lančane reakcije polimeraze (qPCR) zdravih donorskih T-stanica tretiranih s MNA pokazala je da u usporedbi s kontrolnim SK-OV-3 tumorskim stanicama jajnika, NNMT ili AOX1 gotovo nisu eksprimirani (slika 3E). Ovi neočekivani rezultati ukazuju na to da se MNA može izlučivati ​​iz fibroblasta ili tumora u susjedne T-stanice u TME.
Iako kandidati uključuju obitelj organskih kationskih transportera 1 do 3 (OCT1, OCT2 i OCT3) kodiranih obitelji topljivog transportera 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 i SLC22A3), potencijalni transporteri MNA još uvijek nisu definirani (28). QPCR mRNA iz zdravih donorskih T stanica pokazao je niske razine ekspresije SLC22A1, ali nedetektabilne razine SLC22A2, što je potvrdilo da je to prethodno zabilježeno u literaturi (Slika 3F) (29). Nasuprot tome, stanična linija tumora jajnika SK-OV-3 eksprimirala je visoke razine oba transportera (Slika 3F).
Kako bi se testirala mogućnost da T-stanice imaju sposobnost apsorpcije stranog MNA, zdrave donorske T-stanice uzgajane su 72 sata u prisutnosti različitih koncentracija MNA. U odsutnosti egzogenog MNA, stanični sadržaj MNA ne može se detektirati (Slika 3G). Međutim, aktivirane T-stanice tretirane egzogenim MNA pokazale su povećanje sadržaja MNA u stanicama ovisno o dozi, do 6 mM MNA (Slika 3G). Ovaj rezultat ukazuje na to da unatoč niskoj razini ekspresije transportera i nedostatku glavnog enzima odgovornog za unutarstanični metabolizam MNA, TIL i dalje može apsorbirati MNA.
Spektar metabolita u T stanicama pacijenata i in vitro eksperimenti apsorpcije MNA povećavaju mogućnost da fibroblasti povezani s rakom (CAF) luče MNA te da tumorske stanice mogu regulirati fenotip i funkciju TIL-a. Kako bi se utvrdio učinak MNA na T stanice, zdrave donorske T stanice aktivirane su in vitro u prisutnosti ili odsutnosti MNA, a procijenjena je njihova proliferacija i proizvodnja citokina. Nakon 7 dana dodavanja MNA u najvišoj dozi, broj udvostručenja populacije umjereno je smanjen, dok je snaga održana pri svim dozama (Slika 4A). Osim toga, liječenje egzogenim MNA rezultiralo je povećanjem udjela CD4+ i CD8+ T stanica koje eksprimiraju faktor tumorske nekroze-α (TNFα; Slika 4B). Nasuprot tome, unutarstanična proizvodnja IFN-γ značajno je smanjena u CD4+ T stanicama, ali ne i u CD8+ T stanicama, a nije bilo značajne promjene u interleukinu 2 (IL-2; Slika 4, C i D). Stoga je enzimski imunosorbentni test (ELISA) supernatanata iz ovih MNA-tretiranih T-staničnih kultura pokazao značajan porast TNFα, smanjenje IFN-γ i bez promjene IL-2 (Slika 4, E do G). Smanjenje IFN-γ ukazuje na to da MNA može igrati ulogu u inhibiranju antitumorske aktivnosti T-stanica. Kako bi se simulirao učinak MNA na citotoksičnost posredovanu T-stanicama, himerne antigenske receptorske T (FRα-CAR-T) stanice koje ciljaju folatni receptor α i CAR-T (GFP) regulirane zelenim fluorescentnim proteinom (GFP) -CAR-T) stanice proizvode se od zdravih mononuklearnih stanica periferne krvi (PBMC) donora. CAR-T stanice su uzgajane 24 sata u prisutnosti MNA, a zatim su kokultivirane s ljudskim SK-OV-3 tumorskim stanicama jajnika koje eksprimiraju folatni receptor α u omjeru efektora i cilja od 10:1. Tretman MNA rezultirao je značajnim smanjenjem aktivnosti ubijanja FRα-CAR-T stanica, što je bilo slično FRα-CAR-T stanicama tretiranim adenozinom (Slika 4H).
(A) Ukupan broj održivih stanica i udvostručenje populacije (PD) izravno iz kulture 7. dana. Stupčasti grafikon predstavlja srednju vrijednost + SEM šest zdravih donora. Predstavlja podatke iz najmanje n = 3 neovisna eksperimenta. (B do D) CD3/CD28 i IL-2 korišteni su za aktivaciju T stanica pri njihovim odgovarajućim koncentracijama MNA tijekom 7 dana. Prije analize, stanice su stimulirane s PMA/ionomicinom s GolgiStopom tijekom 4 sata. Ekspresija TNFα (B) u T stanicama. Primjer slike (lijevo) i tablični podaci (desno) ekspresije TNFα u živim stanicama. Ekspresija IFN-γ (C) i IL-2 (D) u T stanicama. Ekspresija citokina mjerena je protočnom citometrijom. Stupčasti grafikon predstavlja srednju vrijednost (n = 6 zdravih donora) + SEM. Za određivanje P vrijednosti upotrijebite jednosmjernu analizu varijance i ponovljena mjerenja (*P<0,05 i **P<0,01). Predstavlja podatke iz najmanje n = 3 neovisna eksperimenta. (E do G) CD3/CD28 i IL-2 korišteni su za aktivaciju T stanica pri njihovim odgovarajućim koncentracijama MNA tijekom 7 dana. Medij je prikupljen prije i nakon 4 sata stimulacije PMA/ionomicinom. Koncentracije TNFα (E), IFN-γ (F) i IL-2 (G) izmjerene su ELISA testom. Stupčasti grafikon predstavlja srednju vrijednost (n = 5 zdravih donora) + SEM. P-vrijednost određena je jednosmjernom analizom varijance i ponovljenim mjerenjima (*P<0,05). Isprekidana linija označava granicu detekcije. (H) Test lize stanica. FRα-CAR-T ili GFP-CAR-T stanice su prilagođene adenozinu (250 μM) ili MNA (10 mM) tijekom 24 sata ili su ostavljene netretirane (Ctrl). Mjeren je postotak ubijanja SK-OV-3 stanica. P-vrijednost određena je Welchovim t-testom (*P<0,5 i **P<0,01).
Kako bi se steklo mehanističko razumijevanje regulacije ekspresije TNFα ovisne o MNA, procijenjene su promjene u TNFα mRNA T stanica tretiranih MNA (Slika 5A). Zdrave donorske T stanice tretirane s MNA pokazale su dvostruko povećanje razine transkripcije TNFα, što ukazuje na to da je MNA ovisan o transkripcijskoj regulaciji TNFα. Kako bi se istražio ovaj mogući regulatorni mehanizam, dva poznata transkripcijska faktora koji reguliraju TNFα, naime aktivirani nuklearni faktor T stanica (NFAT) i specifični protein 1 (Sp1), procijenjeni su kao odgovor na vezanje MNA na proksimalni TNFα promotor (30). TNFα promotor sadrži 6 identificiranih mjesta vezanja NFAT-a i 2 mjesta vezanja Sp1, koja se preklapaju na jednom mjestu [-55 baznih parova (bp) od 5' kape] (30). Imunoprecipitacija kromatina (ChIP) pokazala je da se, kada se tretira s MNA, vezanje Sp1 na TNFα promotor utrostručilo. Ugradnja NFAT-a također se povećala i približila se važnosti (Slika 5B). Ovi podaci ukazuju na to da MNA regulira ekspresiju TNFα putem Sp1 transkripcije, a u manjoj mjeri i ekspresiju NFAT-a.
(A) U usporedbi s T stanicama uzgajanim bez MNA, promjena ekspresije TNFα u T stanicama tretiranim s MNA. Prikazan je obrazac ekspresije s SEM-om (n = 5 zdravih donora). Predstavlja podatke iz najmanje n = 3 neovisna eksperimenta. (B) TNFα promotor T stanica tretiranih sa ili bez 8 mM MNA nakon što su NFAT i Sp1 kombinirani s (Ctrl) i PMA/ionomicinom stimulacijom tijekom 4 sata. Imunoglobulin G (IgG) i H3 korišteni su kao negativne i pozitivne kontrole za imunoprecipitaciju. Kvantifikacija ChIP-a pokazala je da se vezanje Sp1 i NFAT-a na TNFα promotor u stanicama tretiranim MNA povećalo nekoliko puta u usporedbi s kontrolom. Predstavlja podatke iz najmanje n = 3 neovisna eksperimenta. P-vrijednost određena višestrukim t-testovima (*** P <0,01). (C) U usporedbi s ascitesom HGSC-a, T stanice (necitotoksične) pokazale su povećanu ekspresiju TNF-a u tumoru. Boje predstavljaju različite pacijente. Prikazane stanice su nasumično uzorkovane na 300 i podrhtavane kako bi se ograničilo prekoračenje (** Padj = 0,0076). (D) Predloženi model MNA za rak jajnika. MNA se proizvodi u tumorskim stanicama i fibroblastima u TME-u, a preuzimaju ga T stanice. MNA povećava vezanje Sp1 na TNFα promotor, što dovodi do povećane transkripcije TNFα i proizvodnje TNFα citokina. MNA također uzrokuje smanjenje IFN-γ. Inhibicija funkcije T stanica dovodi do smanjene sposobnosti ubijanja i ubrzanog rasta tumora.
Prema izvješćima, TNFα ima prednje i stražnje ovisne antitumorske i antitumorske učinke, ali ima dobro poznatu ulogu u poticanju rasta i metastaza raka jajnika (31-33). Prema izvješćima, koncentracija TNFα u ascitesu i tumorskom tkivu kod pacijenata s rakom jajnika je veća nego u benignim tkivima (34-36). Što se tiče mehanizma, TNFα može regulirati aktivaciju, funkciju i proliferaciju bijelih krvnih stanica te promijeniti fenotip stanica raka (37, 38). U skladu s tim nalazima, analiza diferencijalne ekspresije gena pokazala je da je TNF značajno povišen u T stanicama u tumorskom tkivu u usporedbi s ascitesom (Slika 5C). Povećanje ekspresije TNF-a bilo je vidljivo samo u populacijama T stanica s necitotoksičnim fenotipom (Slika S5A). Ukratko, ovi podaci podupiru stav da MNA ima dvostruke imunosupresivne i tumorsko-promotivne učinke u HGSC-u.
Fluorescentno označavanje protočnom citometrijom postalo je glavna metoda za proučavanje metabolizma TIL-a. Ove studije pokazale su da u usporedbi s limfocitima periferne krvi ili T-stanicama iz sekundarnih limfoidnih organa, mišji i ljudski TIL imaju veću sklonost unosu glukoze (4, 39) i postupnom gubitku mitohondrijske funkcije (19, 40). Iako smo u ovoj studiji uočili slične rezultate, ključni razvoj je usporedba metabolizma tumorskih stanica i TIL-a iz istog reseciranog tumorskog tkiva. U skladu s nekim od ovih prethodnih izvješća, tumorske (CD45-EpCAM+) stanice iz ascitesa i tumora imaju veći unos glukoze od CD8+ i CD4+ T-stanica, što podupire tvrdnju da se visoki unos glukoze tumorskih stanica može usporediti s T-stanicama. Koncept konkurencije T-stanica. TME. Međutim, mitohondrijska aktivnost tumorskih stanica veća je od aktivnosti CD8+ T-stanica, ali mitohondrijska aktivnost slična je aktivnosti CD4+ T-stanica. Ovi rezultati pojačavaju temu koja se pojavljuje da je oksidativni metabolizam važan za tumorske stanice (41, 42). Također sugeriraju da CD8+ T stanice mogu biti osjetljivije na oksidativnu disfunkciju od CD4+ T stanica ili da CD4+ T stanice mogu koristiti izvore ugljika osim glukoze za održavanje mitohondrijske aktivnosti (43, 44). Treba napomenuti da nismo uočili razliku u unosu glukoze ili mitohondrijskoj aktivnosti između CD4+ T efektora, T efektorskih memorijskih i T središnjih memorijskih stanica u ascitesu. Slično tome, stanje diferencijacije CD8+ T stanica u tumorima nema nikakve veze s promjenama u unosu glukoze, što ističe značajnu razliku između T stanica uzgajanih in vitro i ljudskog TIL-a in vivo (22). Ova su zapažanja također potvrđena korištenjem nepristrane automatske alokacije stanične populacije, što je dodatno otkrilo da su CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ stanice s većim unosom glukoze i mitohondrijskom aktivnošću od tumorskih stanica prevladavajuće, ali imaju metabolički aktivnu staničnu populaciju. Ova populacija može predstavljati pretpostavljenu subpopulaciju mijeloidnih supresorskih stanica ili plazmacitoidnih dendritičnih stanica identificiranih u scRNA-seq analizi. Iako su oba ova slučaja zabilježena kod tumora jajnika kod ljudi [45], još uvijek je potrebno daljnje istraživanje kako bi se opisala ova mijeloidna subpopulacija.
Iako metode temeljene na protočnoj citometriji mogu razjasniti opće razlike u metabolizmu glukoze i oksidativnom metabolizmu između tipova stanica, precizni metaboliti koje proizvodi glukoza ili drugi izvori ugljika za mitohondrijski metabolizam u TME još nisu određeni. Dodjeljivanje prisutnosti ili odsutnosti metabolita određenom podskupu TIL-a zahtijeva pročišćavanje stanične populacije iz izrezanog tkiva. Stoga, naša metoda obogaćivanja stanica u kombinaciji s masenom spektrometrijom može pružiti uvid u metabolite koji su različito obogaćeni u T stanicama i populacijama tumorskih stanica u odgovarajućim uzorcima pacijenata. Iako ova metoda ima prednosti u odnosu na sortiranje stanica aktivirano fluorescencijom, određene biblioteke metabolita mogu biti pogođene zbog inherentne stabilnosti i/ili brze brzine izmjene (22). Ipak, naša metoda je uspjela identificirati dva prepoznata imunosupresivna metabolita, adenozin i kinurenin, jer se oni uvelike razlikuju između tipova uzoraka.
Naša metabonomska analiza tumora i podtipova TIL-a pruža više uvida u ulogu metabolita u TME jajnika. Prvo, protočnom citometrijom utvrdili smo da nema razlike u mitohondrijskoj aktivnosti između tumora i CD4+ T stanica. Međutim, LC-MS/MS analiza otkrila je značajne promjene u količini metabolita među tim populacijama, što ukazuje na to da zaključci o metabolizmu TIL-a i njegovoj ukupnoj metaboličkoj aktivnosti zahtijevaju pažljivo tumačenje. Drugo, MNA je metabolit s najvećom razlikom između CD45-stanica i T stanica u ascitesu, a ne u tumorima. Stoga, kompartmentacija i lokacija tumora mogu imati različite učinke na metabolizam TIL-a, što naglašava moguću heterogenost u danom mikrookruženju. Treće, ekspresija enzima NNMT koji proizvodi MNA uglavnom je ograničena na CAF, što je u manjoj mjeri tumorske stanice, ali detektabilne razine MNA uočene su u T stanicama izvedenim iz tumora. Prekomjerna ekspresija NNMT-a u CAF jajnika ima poznati učinak poticanja raka, dijelom zbog poticanja metabolizma CAF-a, invazije tumora i metastaza (27). Iako je ukupna razina TIL-a umjerena, ekspresija NNMT-a u CAF-u usko je povezana s mezenhimskim podtipom Atlasa genoma raka (TCGA), koji je povezan s lošom prognozom (27, 46, 47). Konačno, ekspresija enzima AOX1 odgovornog za razgradnju MNA također je ograničena na populaciju CAF-a, što ukazuje na to da T-stanice nemaju sposobnost metaboliziranja MNA. Ovi rezultati podupiru ideju da, iako je potrebno daljnje istraživanje kako bi se potvrdio ovaj nalaz, visoke razine MNA u T-stanicama mogu ukazivati ​​na prisutnost imunosupresivnog mikrookruženja CAF-a.
S obzirom na nisku razinu ekspresije MNA transportera i nedetektabilne razine ključnih proteina uključenih u metabolizam MNA, prisutnost MNA u T stanicama je neočekivana. Ni NNMT ni AOX1 nisu mogli biti detektirani scRNA-seq analizom i ciljanom qPCR-om dviju neovisnih kohorti. Ovi rezultati ukazuju na to da MNA ne sintetiziraju T stanice, već se apsorbira iz okolnog TME-a. In vitro eksperimenti pokazuju da T stanice imaju tendenciju akumuliranja egzogenog MNA.
Naše in vitro studije pokazale su da egzogeni MNA inducira ekspresiju TNFα u T stanicama i pojačava vezanje Sp1 na TNFα promotor. Iako TNFα ima i antitumorske i antitumorske funkcije, kod raka jajnika, TNFα može potaknuti rast raka jajnika (31-33). Neutralizacija TNFα u kulturi tumorskih stanica jajnika ili uklanjanje TNFα signala u mišjim modelima može poboljšati proizvodnju upalnih citokina posredovanih TNFα i inhibirati rast tumora (32, 35). Stoga, u ovom slučaju, MNA izveden iz TME-a može djelovati kao proupalni metabolit putem mehanizma ovisnog o TNFα kroz autokrinu petlju, čime potiče pojavu i širenje raka jajnika (31). Na temelju ove mogućnosti, blokada TNFα se proučava kao potencijalno terapijsko sredstvo za rak jajnika (37, 48, 49). Osim toga, MNA smanjuje citotoksičnost CAR-T stanica na tumorske stanice jajnika, pružajući daljnje dokaze za imunosupresiju posredovanu MNA-om. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju model u kojem tumori i CAF stanice luče MNA u izvanstanični TME. Kroz (i) stimulaciju rasta raka jajnika induciranu TNF-om i (ii) inhibiciju citotoksične aktivnosti T-stanica induciranu MNA-om, ovo može imati dvostruki tumorski učinak (Slika 5D).
Zaključno, primjenom kombinacije brzog obogaćivanja stanica, sekvenciranja pojedinačnih stanica i metaboličkog profiliranja, ova studija otkrila je ogromne imunometabolomske razlike između tumorskih i ascitesnih stanica kod pacijenata s HGSC-om. Ova sveobuhvatna analiza pokazala je da postoje razlike u unosu glukoze i mitohondrijskoj aktivnosti između T stanica te je identificirala MNA kao nestanični autonomni imunološki regulatorni metabolit. Ovi podaci utječu na to kako TME utječe na metabolizam T stanica u ljudskim karcinomima. Iako je zabilježena izravna konkurencija za hranjive tvari između T stanica i stanica raka, metaboliti također mogu djelovati kao neizravni regulatori koji potiču napredovanje tumora i moguće potiskuju endogene imunološke odgovore. Daljnji opis funkcionalne uloge ovih regulatornih metabolita mogao bi otvoriti alternativne strategije za poboljšanje antitumorskog imunološkog odgovora.
Uzorci pacijenata i klinički podaci dobiveni su putem repozitorija tkiva tumora raka dojke koji je certificirala Kanadska mreža repozitorija tkiva. Prema protokolu koji su odobrili Etički odbor za istraživanje raka dojke i Sveučilište Britanske Kolumbije (H07-00463), svi uzorci i klinički podaci pacijenata dobili su informirani pisani pristanak ili su formalno odrekli pristanka. Uzorci se pohranjuju u certificiranoj BioBank (BRC-00290). Detaljne karakteristike pacijenata prikazane su u tablicama S1 i S5. Za krioprezervaciju, skalpel se koristi za mehaničku razgradnju uzorka tumora pacijenta, a zatim se progurava kroz filter od 100 mikrona kako bi se dobila suspenzija pojedinačnih stanica. Pacijentov ascites centrifugiran je pri 1500 okretaja u minuti tijekom 10 minuta na 4°C kako bi se stanice istaložile i uklonio supernatant. Stanice dobivene iz tumora i ascitesa krioprezervirane su u 50% toplinski inaktiviranom ljudskom AB serumu (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) i 10% dimetil sulfoksidu. Ove konzervirane suspenzije pojedinačnih stanica su odmrznute i korištene za metabolomiku i određivanje metabolita opisano u nastavku.
Potpuni medij sastoji se od 0,22 μm filtriranog 50:50 RPMI 1640:AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) nadopunjenog s 10% toplinski inaktiviranog ljudskog AB seruma (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepesa (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific), 1 x otopine penicilina i streptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) i 50 μMB-merkaptoetanola. AimV (Invitrogen) nadopunjen je s 20 mM Hepesa (Thermo Fisher Scientific) i 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific). Pufer za bojenje protočnog citometra sastojao se od 0,22 μm filtrirane fosfatno puferirane fiziološke otopine (PBS; Invitrogen) nadopunjene s 3% toplinski inaktiviranog AB ljudskog seruma (Sigma). Pufer za obogaćivanje stanica sastoji se od 0,22 μm filtriranog PBS-a i nadopunjenog s 0,5% toplinski inaktiviranog humanog AB seruma (Sigma-Aldrich).
U kompletnom mediju na 37°C, stanice su obojene s 10 nM MT DR i 100 μM 2-NBDG tijekom 30 minuta. Zatim su stanice obojene bojom za održivost eF506 na 4°C tijekom 15 minuta. Resuspendirajte stanice u FC Block (eBioscience) i Brilliant Stain Bufferu (BD Biosciences), razrijedite u puferu za bojenje protočne citometrije (prema uputama proizvođača) i inkubirajte 10 minuta na sobnoj temperaturi. Obojite stanice skupom antitijela (Tablica S2) u puferu za bojenje protočne citometrije na 4°C tijekom 20 minuta. Prije analize resuspendirajte stanice u puferu za bojenje protočne citometrije (Cytek Aurora; konfiguracija 3L-16V-14B-8R). Za analizu podataka o broju stanica upotrijebite SpectroFlo i FlowJo V10, a za stvaranje podataka upotrijebite GraphPad Prism 8. Medijan intenziteta fluorescencije (MFI) 2-NBDG i MT DR je logaritamski normaliziran, a zatim je za statističku analizu korišten t-test za uparivanje kako bi se uzeli u obzir podudarni pacijenti. Uklonite iz analize sve populacije s manje od 40 događaja; unesite vrijednost MFI od 1 za sve negativne vrijednosti prije izvođenja statističke analize i vizualizacije podataka.
Kako bismo nadopunili strategiju ručnog usklađivanja gore navedene procesne ploče, koristili smo punu anotaciju pomoću stabla ograničenja oblika (FAUST) (21) kako bismo automatski dodijelili stanice populaciji nakon uklanjanja mrtvih stanica u FlowJo-u. Ručno upravljamo izlazom kako bismo spojili populacije koje se čine pogrešno dodijeljenima (kombiniranjem PD1+ s PD1-tumorskim stanicama) i zadržanih populacija. Svaki uzorak sadrži prosječno više od 2% stanica, za ukupno 11 populacija.
Za odvajanje PBMC-a od produkata separacije leukocita korišteno je centrifugiranje s gradijentom gustoće Ficolla (STEMCELL Technologies). CD8+ T stanice izolirane su iz PBMC-a pomoću CD8 MicroBeads (Miltenyi) i ekspandirane u potpunom mediju pomoću TransAct-a (Miltenyi) tijekom 2 tjedna prema uputama proizvođača. Stanice su ostavljene da stoje 5 dana u potpunom mediju koji sadrži IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), a zatim ponovno stimulirane s TransAct-om. 7. dana, prema uputama proizvođača, korištene su ljudske CD45 MicroBeads (Miltenyi) za obogaćivanje stanica u tri uzastopna kruga. Stanice su alikvotirane za analizu protočnom citometrijom (kao što je gore opisano), a milijun stanica je alikvotirano tri puta za LC-MS/MS analizu. Uzorci su obrađeni LC-MS/MS-om kao što je opisano u nastavku. Vrijednost nedostajućeg metabolita procijenili smo s ionskim brojem od 1000. Svaki uzorak se normalizira ukupnim brojem iona (TIC), logaritamski pretvara i automatski normalizira u MetaboAnalystR-u prije analize.
Suspenzija pojedinačnih stanica svakog pacijenta odmrznuta je i filtrirana kroz filter od 40 μm u kompletni medij (kao što je gore opisano). Prema protokolu proizvođača, tri uzastopna kruga pozitivne selekcije magnetskom separacijom kuglica pomoću MicroBeads (Miltenyi) korištena su za obogaćivanje uzoraka za CD8+, CD4+ i CD45- stanice (na ledu). Ukratko, stanice se resuspendiraju u puferu za obogaćivanje stanica (kao što je gore opisano) i prebroje. Stanice su inkubirane s ljudskim CD8 kuglicama, ljudskim CD4 kuglicama ili ljudskim CD45 kuglicama (Miltenyi) na 4°C tijekom 15 minuta, a zatim isprane puferom za obogaćivanje stanica. Uzorak se propušta kroz LS kolonu (Miltenyi) i skupljaju se pozitivne i negativne frakcije. Kako bi se smanjilo trajanje i maksimizirao korak oporavka stanica, CD8-frakcija se zatim koristi za drugi krug obogaćivanja CD4+, a CD4-frakcija se koristi za naknadno obogaćivanje CD45. Otopinu držite na ledu tijekom cijelog procesa separacije.
Za pripremu uzoraka za analizu metabolita, stanice su jednom isprane ledeno hladnom otopinom soli, a svakom uzorku je dodan 1 ml 80%-tnog metanola, zatim su vrtložene i brzo zamrznute u tekućem dušiku. Uzorci su podvrgnuti trima ciklusima smrzavanja i odmrzavanja te centrifugirani pri 14 000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta na 4 °C. Supernatant koji sadrži metabolite isparava se dok se ne osuši. Metaboliti su ponovno otopljeni u 50 μl 0,03%-tne mravlje kiseline, vrtloženi radi miješanja, a zatim centrifugirani radi uklanjanja ostataka.
Ekstrahirajte metabolite kako je gore opisano. Supernatant prebacite u bocu za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti za metabolomska istraživanja. Koristite protokol slučajnog tretmana za tretiranje svakog uzorka sa sličnim brojem stanica kako biste spriječili učinke serije. Proveli smo kvalitativnu procjenu globalnih metabolita prethodno objavljenu na AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Kromatografska analiza i integracija površine vrha provedene su pomoću softvera MultiQuant verzije 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Za procjenu vrijednosti nedostajućeg metabolita korišten je broj iona od 1000, a TIC svakog uzorka korišten je za izračun normalizirane površine vrha svakog detektiranog metabolita kako bi se ispravile promjene uvedene instrumentalnom analizom obrade uzorka. Nakon normalizacije TIC-a, MetaboAnalystR(51) (zadani parametar) koristi se za logaritamsku pretvorbu i automatsko skaliranje normativne linije. Koristili smo PCA s veganskim R paketom za provođenje istraživačke analize razlika metaboloma između tipova uzoraka i koristili smo analizu parcijalne redundancije za analizu pacijenata. Koristili smo Wardovu metodu za izradu dendrograma toplinske karte kako bismo grupirali euklidsku udaljenost između uzoraka. Koristili smo limu (52) na standardiziranoj količini metabolita kako bismo identificirali različito obilne metabolite u cijelom tipu stanica i mikrookruženju. Kako bismo pojednostavili objašnjenje, koristimo parametar srednje vrijednosti grupe za određivanje modela i razmatramo tipove stanica u mikrookruženju kao svaku skupinu (n = 6 skupina); za test značajnosti izvršili smo tri ponovljena mjerenja za svaki metabolit. Kako bismo izbjegli lažnu replikaciju, pacijent je uključen kao prepreka u dizajn lime. Kako bismo provjerili razlike u metabolitima između različitih pacijenata, prilagodili smo model lime uključujući pacijente na fiksni način. Izvještavamo o značajnosti unaprijed određenog kontrasta između tipa stanice i mikrookruženja Padj <0,05 (Benjamini-Hochbergova korekcija).
Nakon obogaćivanja energijom pomoću Miltenyi Dead Cell Removal Kit-a (>80% vijabilnosti), provedeno je sekvenciranje transkriptoma pojedinačnih stanica na uzorcima ukupnog živog smrznutog ascitesa i tumora korištenjem 10x 5′ protokola ekspresije gena. Analizirano je pet slučajeva s odgovarajućim tumorima i ascitesom, iako je niska vijabilnost jednog uzorka tumora spriječila njegovo uključivanje. Kako bismo postigli višestruki odabir pacijenata, kombinirali smo uzorke svakog pacijenta u trakama 10x krom kontrolera i zasebno analizirali mjesta ascitesa i tumora. Nakon sekvenciranja [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; prosječno 73.488 i 41.378 očitanja po stanici za tumor i ascites]], koristili smo CellSNP i Vireo (53) (na temelju CellSNP-a kao...). Uobičajeni ljudski SNP (VCF) koji pruža GRCh38 dodjeljuje se identitetu donora. Koristimo SNPRelate za zaključivanje o najbližem identitetu (IBS) pacijentovog genotipskog statusa (IBS), isključujući nedodijeljene stanice i stanice identificirane kao dupleksi te odgovarajuće donore između uzoraka ascitesa i tumora (54). Na temelju ovog zadatka zadržali smo tri slučaja s obilnom zastupljenošću stanica u tumoru i ascitesu za daljnju analizu. Nakon što smo proveli korak filtracije mase u scater (55) i scran (56) BioConductor pakiranju, dobiveno je 6975 stanica (2792 i 4183 stanice iz tumora i ascitesa) za analizu. Koristimo igraphovo (57) Louvainovo grupiranje dijeljene mreže najbližih susjeda (SNN) na temelju Jaccardove udaljenosti do stanica klastera ekspresijom. Klasteri su ručno označeni kao pretpostavljeni tipovi stanica na temelju ekspresije marker gena i vizualizirani pomoću t-SNE. Citotoksične T stanice definirane su ekspresijom CD8A i GZMA, isključujući podklastere s niskom ekspresijom ribosomskih proteina. Pristupili smo objavljenim podacima Izara i suradnika (16), uključujući njihovo ugrađivanje t-SNE, koji mogu kontrolirati preklapanje ekspresije između markera imunoloških stanica i ekspresije NNMT-a.
PBMC su odvojene od produkata separacije leukocita (STEMCELL Technologies) centrifugiranjem s gradijentom gustoće Ficolla. CD3+ stanice su izolirane iz PBMC pomoću CD3 kuglica (Miltenyi). U prisutnosti ili odsutnosti MNA, CD3+ stanice su aktivirane s CD3 vezanim na ploču (5μg/ml), topljivim CD28 (3μg/ml) i IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Posljednjeg dana ekspanzije, vijabilnost (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) i proliferacija (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) procijenjene su protočnom citometrijom. Procijenite efektorsku funkciju stimuliranjem stanica s PMA (20 ng/ml) i ionomicinom (1 μg/ml) s GolgiStopom tijekom 4 sata, te pratite CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) i TNFα-fluorescein izotiocijanat (FITC) (MAb11, BD). Stimulirajte qPCR i ChIP stanice s PMA (20 ng/ml) i ionomicinom (1 μg/ml) tijekom 4 sata. ELISA supernatant je prikupljen prije i nakon stimulacije s PMA (20 ng/ml) i ionomicinom (1 μg/ml) tijekom 4 sata.
Slijedite protokol proizvođača za izolaciju RNA pomoću RNeasy Plus Mini Kita (QIAGEN). Za homogenizaciju uzorka upotrijebite QIAshredder (QIAGEN). Za sintezu komplementarne DNA (cDNA) upotrijebite kit visokog kapaciteta RNA za cDNA (Thermo Fisher Scientific). Za kvantifikaciju ekspresije gena (prema protokolu proizvođača) upotrijebite TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) sa sljedećim probama: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehid-3-fosfat bez vodika (GAPDH)] i Hs01010726_m1 (SLC22A2). Uzorci su analizirani na StepOnePlus sustavu za PCR u stvarnom vremenu (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) u MicroAmp brzoj optičkoj reakcijskoj pločici s 96 jažica (Applied Biosystems) s MicroAmp optičkim filmom. Svaka Ct vrijednost koja prelazi 35 smatra se iznad praga detekcije i označava se kao nedetektabilna.
Provedite ChIP kako je prethodno opisano (58). Ukratko, stanice su tretirane formaldehidom (konačna koncentracija 1,42%) i inkubirane na sobnoj temperaturi 10 minuta. Koristite nadopunjeni pufer za bubrenje (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl i 0,1% NP-40) na ledu 10 minuta, zatim resuspendirajte u imunoprecipitacijskom puferu kako je opisano (58). Uzorak je zatim soniciran sljedećim ciklusima: 10 ciklusa (20 pulseva od 1 sekunde) i statičkim vremenom od 40 sekundi. Inkubirajte ChIP-kvalitet imunoglobulina G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histona H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) i SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) antitijela s uzorkom na 4°C i protresite preko noći. Inkubirajte kuglice proteina A (Thermo Fisher Scientific) s uzorkom na 4°C uz lagano trešnju tijekom 1 sata, zatim upotrijebite chelex kuglice (Bio-Rad) za obogaćivanje DNA i upotrijebite proteinazu K (Thermo Fisher) za razgradnju proteina. TNFα promotor je detektiran PCR-om: naprijed, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; nasuprot tome, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produkt od 207 bp). Slike je izradio Image Lab (Bio-Rad) i kvantificirao pomoću ImageJ softvera.
Supernatant stanične kulture prikupljen je kako je gore opisano. Određivanje je provedeno prema postupcima proizvođača za ELISA kit za humani TNFα (Invitrogen), ELISA kit za humani IL-2 (Invitrogen) i ELISA kit za humani IFN-γ (Abcam). Prema protokolu proizvođača, supernatant je razrijeđen 1:100 za detekciju TNFα i IL-2, te 1:3 za detekciju IFN-γ. Za mjerenje apsorbancije na 450 nm upotrijebite EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer).
PBMC su odvojene od produkata separacije leukocita (STEMCELL Technologies) centrifugiranjem s gradijentom gustoće Ficolla. CD3+ stanice su izolirane iz PBMC pomoću CD3 kuglica (Miltenyi). U prisutnosti ili odsutnosti MNA, CD3+ stanice su aktivirane s CD3 vezanim na ploču (5μg/ml), topljivim CD28 (3μg/ml) i IL-2 (300 U/ml; Proleukin) tijekom 3 dana. Nakon 3 dana, stanice su sakupljene i isprane s 0,9%-tnom fiziološkom otopinom, a talog je brzo zamrznut. Brojanje stanica provedeno je protočnom citometrijom (Cytek Aurora; konfiguracija 3L-16V-14B-8R) korištenjem eBeads od 123 count.
Ekstrakt metabolita se vrši kako je gore opisano. Osušeni ekstrakt je rekonstituiran u koncentraciji od 4000 staničnih ekvivalenata/μl. Uzorak se analizira kromatografijom reverzne faze (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i kolonom CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, veličina čestica 1,6 μm, veličina pora 120 Å; #186008500, Waters). Polarni maseni spektrometar (6470, Agilent), u kojem elektrosprejna ionizacija radi u pozitivnom načinu rada. Mobilna faza A je 0,1% mravlja kiselina (u H2O), mobilna faza B je 90% acetonitril, 0,1% mravlja kiselina. LC gradijent je 0 do 2 minute za 100% A, 2 do 7,1 minuta za 99% B i 7,1 do 8 minuta za 99% B. Zatim ponovno uravnotežite kolonu s mobilnom fazom A pri brzini protoka od 0,6 ml/min tijekom 3 minute. Brzina protoka je 0,4 ml/min, a komora kolone se zagrijava na 50°C. Koristite MNA-ov standard čistog kemijskog spoja (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) za određivanje vremena zadržavanja (RT) i transformacije (RT = 0,882 minute, transformacija 1 = 137→94,1, transformacija 2 = 137→92, konverzija 3 = 137→78). Kada se sva tri prijelaza dogode u ispravnom vremenu zadržavanja, prijelaz 1 se koristi za kvantifikaciju kako bi se osigurala specifičnost. Standardna krivulja MNA (Toronto Research Chemical Company) generirana je pomoću šest serijskih razrjeđenja osnovne otopine (1 mg/ml) kako bi se dobili standardi od 0,1, 1,0, 10 i 100 ng/ml te 1,0 i 10 μg/ml tekućine. Granica detekcije je 1 ng/ml, a linearni odgovor je između 10 ng/ml i 10 μg/ml. Svaka injekcija od dva mikrolitra uzorka i standarda koristi se za LC/MS analizu, a miješani uzorak kontrole kvalitete provodi se svakih osam injekcija kako bi se osigurala stabilnost analitičke platforme. MNA odgovori svih uzoraka stanica tretiranih MNA bili su unutar linearnog raspona testa. Analiza podataka provedena je pomoću softvera za kvantitativnu analizu MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstrukt αFR-CAR druge generacije preuzet je od Songa i suradnika (59). Ukratko, konstrukt sadrži sljedeći sadržaj: vodeću sekvencu CD8a, ljudski αFR-specifični varijabilni fragment jednog lanca, zglobnu i transmembransku regiju CD8a, unutarstanično područje CD27 i unutarstanično područje CD3z. Potpuni CAR slijed sintetiziran je pomoću GenScripta, a zatim kloniran u lentivirusni ekspresijski vektor druge generacije uzvodno od GFP ekspresijske kasete korištene za procjenu učinkovitosti transdukcije.
Lentivirus se proizvodi transfekcijom stanica HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); uzgajane u Dulbeccoovom modificiranom Eagle mediju koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1% PenStrepa, a korišten je CAR-GFP vektor i plazmidi za pakiranje (psPAX2 i pMD2.G, Addgene) koriste lipofekcijski amin (Sigma-Aldrich). Supernatant koji sadrži virus sakupljen je 48 i 72 sata nakon transfekcije, filtriran i koncentriran ultracentrifugiranjem. Koncentrirani virusni supernatant čuva se na -80°C do transdukcije.
PBMC se odvajaju od produkata separacije leukocita zdravih donora (STEMCELL Technologies) centrifugiranjem s Ficoll gradijentom gustoće. Za izolaciju CD8+ stanica iz PBMC upotrijebite CD8 mikrokuglice pozitivne selekcije (Miltenyi). Stimulirajte T stanice s TransAct (Miltenyi) i u TexMACS mediju [Miltenyi; nadopunjen s 3% toplinski inaktiviranog ljudskog seruma, 1% PenStrep i IL-2 (300 U/ml)]. Dvadeset četiri sata nakon stimulacije, T stanice su transducirane lentivirusom (10 μl koncentriranog virusnog supernatanta na 106 stanica). 1 do 3 dana nakon transdukcije na Cytek Aurora (na FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), procijenite GFP ekspresiju stanica kako biste pokazali učinkovitost transdukcije od najmanje 30%.
CAR-T stanice su uzgajane 24 sata u Immunocultu (STEMCELL Technologies; nadopunjeno s 1% PenStrepa) pod sljedećim uvjetima: netretirane, tretirane s 250 μM adenozina ili 10 mM MNA. Nakon prethodne obrade, CAR-T stanice su isprane s PBS-om i kombinirane s 20 000 SK-OV-3 stanica [ATCC; u McCoy 5A mediju (Sigma-Aldrich) nadopunjenom s 10% FBS-a i 1% PenStrepa pri 10: Omjer efektora i cilja od 1 je amplificiran u tri primjerka u nadopunjenom Immunocult mediju. SK-OV-3 stanice i SK-OV-3 stanice lizirane s digitalis saponinom (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) korištene su kao negativne, odnosno pozitivne kontrole. Nakon 24 sata kokultivacije, supernatant je sakupljen i laktat dehidrogenaza (LDH) je izmjerena prema uputama proizvođača (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH supernatant je razrijeđen 1:50 u LDH puferu. Postotak ubijanja mjeren je pomoću sljedeće formule: postotak ubijanja = postotak korekcije / maksimalna stopa ubijanja x 100%, gdje je postotak korekcije = samo ko-kultura-T stanica, a maksimalna stopa ubijanja = pozitivna kontrola-negativna kontrola.
Kao što je opisano u tekstu ili materijalima i metodama, za statističku analizu koristite GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ili R v3.6.0. Ako se od istog pacijenta prikupi više uzoraka (kao što su ascites i tumor), koristimo t-test za uparene uzorke ili uključujemo pacijenta kao slučajni učinak u linearni ili generalizirani model prema potrebi. Za metabolomsku analizu, test važnosti provodi se u tri ponavljanja.
Za dodatne materijale za ovaj članak, pogledajte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod uvjetima Creative Commons licence Imenovanje-Nekomercijalno, koja dopušta korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, sve dok konačna upotreba nije u komercijalne svrhe i pretpostavka je da je izvorno djelo ispravno. Referenca.
Napomena: Molimo vas da navedete svoju adresu e-pošte samo kako bi osoba koju preporučite stranici znala da želite da vidi e-poštu i da se ne radi o neželjenoj pošti. Nećemo prikupljati nikakve adrese e-pošte.
Ovo pitanje se koristi za provjeru jeste li posjetitelj i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA doprinosi imunosupresiji T stanica i predstavlja potencijalnu metu imunoterapije za liječenje raka kod ljudi.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA doprinosi imunosupresiji T stanica i predstavlja potencijalnu metu imunoterapije za liječenje raka kod ljudi.
©2021 Američka udruga za napredak znanosti. sva prava pridržana. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.