Propionska kiselina (PPA), antifungalno sredstvo i uobičajeni dodatak prehrani, dokazano uzrokuje abnormalni neurološki razvoj kod miševa praćen gastrointestinalnom disfunkcijom, što može biti uzrokovano crijevnom disbiozom. Veza između izloženosti PPA u prehrani i disbioze crijevne mikrobiote je sugerirana, ali nije izravno istražena. Ovdje smo istražili promjene u sastavu crijevne mikrobiote povezane s PPA koje mogu dovesti do disbioze. Crijevni mikrobiomi miševa hranjenih netretiranom prehranom (n=9) i prehranom obogaćenom PPA (n=13) sekvencirani su korištenjem metagenomskog sekvenciranja dugog dometa kako bi se procijenile razlike u mikrobnom sastavu i bakterijskim metaboličkim putovima. PPA u prehrani bila je povezana s povećanjem brojnosti značajnih taksona, uključujući nekoliko vrsta Bacteroides, Prevotella i Ruminococcus, čiji su članovi prethodno bili uključeni u proizvodnju PPA. Mikrobiomi miševa izloženih PPA također su imali više putova povezanih s metabolizmom lipida i biosintezom steroidnih hormona. Naši rezultati pokazuju da PPA može promijeniti crijevnu mikrobiotu i s njom povezane metaboličke putove. Ove uočene promjene naglašavaju da konzervansi klasificirani kao sigurni za konzumaciju mogu utjecati na sastav crijevne mikrobiote i, posljedično, na ljudsko zdravlje. Među njima se odabire P, G ili S ovisno o razini klasifikacije koja se analizira. Kako bi se smanjio utjecaj lažno pozitivnih klasifikacija, usvojen je minimalni prag relativne abundancije od 1e-4 (1/10 000 očitanja). Prije statističke analize, relativne abundancije koje je prijavio Bracken (fraction_total_reads) transformirane su pomoću transformacije centriranog logaritamskog omjera (CLR) (Aitchison, 1982). CLR metoda je odabrana za transformaciju podataka jer je nepromjenjiva u odnosu na skalu i dovoljna je za nerijetke skupove podataka (Gloor i sur., 2017). CLR transformacija koristi prirodni logaritam. Podaci o brojanju koje je prijavio Bracken normalizirani su pomoću relativnog logaritamskog izraza (RLE) (Anders i Huber, 2010). Slike su generirane korištenjem kombinacije matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 i sekvencijalnih logaritama (Gloor i sur., 2017). 0.12.2 i stantanotacije v. 0.5.0 (Hunter, 2007.; Waskom, 2021.; Charlier i sur., 2022.). Omjer Bacillus/Bacteroidetes izračunat je za svaki uzorak korištenjem normaliziranog broja bakterija. Vrijednosti prikazane u tablicama zaokružene su na 4 decimalna mjesta. Simpsonov indeks raznolikosti izračunat je korištenjem skripte alpha_diversity.py koja se nalazi u paketu KrakenTools v. 1.2 (Lu i sur., 2022.). Brackenovo izvješće dostupno je u skripti, a Simpsonov indeks "Si" naveden je za parametar -an. Značajne razlike u brojnosti definirane su kao srednje razlike CLR ≥ 1 ili ≤ -1. Srednja razlika CLR od ±1 označava 2,7-struko povećanje brojnosti vrste uzorka. Znak (+/-) označava je li takson brojniji u PPA uzorku odnosno kontrolnom uzorku. Značajnost je određena Mann-Whitneyjevim U testom (Virtanen i sur., 2020.). Korišten je Statsmodels v. 0.14 (Benjamini i Hochberg, 1995.; Seabold i Perktold, 2010.), a Benjamini-Hochbergov postupak primijenjen je za korekciju višestrukog testiranja. Prilagođena p-vrijednost ≤ 0,05 korištena je kao prag za određivanje statističke značajnosti.
Ljudski mikrobiom često se naziva „posljednjim organom tijela“ i igra vitalnu ulogu u ljudskom zdravlju (Baquero i Nombela, 2012.). Posebno je crijevni mikrobiom prepoznat po svom utjecaju na cijeli sustav i ulozi u mnogim bitnim funkcijama. Komenzalne bakterije obiluju u crijevima, zauzimajući više ekoloških niša, koristeći hranjive tvari i natječući se s potencijalnim patogenima (Jandhyala i sur., 2015.). Različite bakterijske komponente crijevnog mikrobiota sposobne su proizvoditi esencijalne hranjive tvari poput vitamina i poticati probavu (Rowland i sur., 2018.). Također je dokazano da bakterijski metaboliti utječu na razvoj tkiva i poboljšavaju metaboličke i imunološke putove (Heijtz i sur., 2011.; Yu i sur., 2022.). Sastav ljudskog crijevnog mikrobioma izuzetno je raznolik i ovisi o genetskim i okolišnim čimbenicima poput prehrane, spola, lijekova i zdravstvenog stanja (Kumbhare i sur., 2019.).
Majčina prehrana ključna je komponenta fetalnog i neonatalnog razvoja te pretpostavljeni izvor spojeva koji mogu utjecati na razvoj (Bazer i sur., 2004.; Innis, 2014.). Jedan takav zanimljiv spoj je propionska kiselina (PPA), nusproizvod kratkolančane masne kiseline dobiven bakterijskom fermentacijom i aditiv za hranu (den Besten i sur., 2013.). PPA ima antibakterijska i antifungalna svojstva te se stoga koristi kao konzervans za hranu i u industrijskim primjenama za inhibiranje rasta plijesni i bakterija (Wemmenhove i sur., 2016.). PPA ima različite učinke u različitim tkivima. U jetri, PPA ima protuupalne učinke utječući na ekspresiju citokina u makrofagima (Kawasoe i sur., 2022.). Ovaj regulatorni učinak uočen je i u drugim imunološkim stanicama, što dovodi do smanjenja upale (Haase i sur., 2021.). Međutim, suprotan učinak uočen je u mozgu. Prethodne studije pokazale su da izloženost PPA izaziva ponašanje slično autizmu kod miševa (El-Ansary i sur., 2012.). Druge studije su pokazale da PPA može izazvati gliozu i aktivirati proupalne puteve u mozgu (Abdelli i sur., 2019.). Budući da je PPA slaba kiselina, može difundirati kroz crijevni epitel u krvotok i tako prijeći restriktivne barijere, uključujući krvno-moždanu barijeru, kao i placentu (Stinson i sur., 2019.), što ističe važnost PPA kao regulatornog metabolita koji proizvode bakterije. Iako se potencijalna uloga PPA kao faktora rizika za autizam trenutno istražuje, njezini učinci na osobe s autizmom mogu se proširiti dalje od samog izazivanja neuronske diferencijacije.
Gastrointestinalni simptomi poput proljeva i zatvora česti su kod pacijenata s neurološkim razvojnim poremećajima (Cao i sur., 2021.). Prethodne studije pokazale su da se mikrobiom pacijenata s poremećajima iz autističnog spektra (PAS) razlikuje od mikrobioma zdravih osoba, što upućuje na prisutnost disbioze crijevne mikrobiote (Finegold i sur., 2010.). Slično tome, karakteristike mikrobioma pacijenata s upalnim bolestima crijeva, pretilošću, Alzheimerovom bolešću itd. također se razlikuju od karakteristika zdravih osoba (Turnbaugh i sur., 2009.; Vogt i sur., 2017.; Henke i sur., 2019.). Međutim, do danas nije utvrđena uzročna veza između crijevnog mikrobioma i neuroloških bolesti ili simptoma (Yap i sur., 2021.), iako se smatra da nekoliko bakterijskih vrsta igra ulogu u nekim od ovih bolesnih stanja. Na primjer, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio i drugi rodovi su obilniji u mikrobioti pacijenata s autizmom (Tomova i sur., 2015.; Golubeva i sur., 2017.; Cristiano i sur., 2018.; Zurita i sur., 2020.). Značajno je da je poznato da vrste članova nekih od ovih rodova posjeduju gene povezane s proizvodnjom PPA (Reichardt i sur., 2014.; Yun i Lee, 2016.; Zhang i sur., 2019.; Baur i Dürre, 2023.). S obzirom na antimikrobna svojstva PPA, povećanje njezine količine može biti korisno za rast bakterija koje proizvode PPA (Jacobson i sur., 2018.). Dakle, okruženje bogato PFA može dovesti do promjena u crijevnoj mikrobioti, uključujući gastrointestinalne patogene, što mogu biti potencijalni čimbenici koji dovode do gastrointestinalnih simptoma.
Središnje pitanje u istraživanju mikrobioma jest jesu li razlike u sastavu mikroba uzrok ili simptom temeljnih bolesti. Prvi korak prema razjašnjavanju složenog odnosa između prehrane, crijevnog mikrobioma i neuroloških bolesti jest procjena učinaka prehrane na sastav mikroba. U tu svrhu koristili smo metagenomsko sekvenciranje dugih čitanja kako bismo usporedili crijevne mikrobiome potomstva miševa hranjenih prehranom bogatom ili siromašnom PPA. Potomci su hranjeni istom prehranom kao i njihove majke. Pretpostavili smo da će prehrana bogata PPA rezultirati promjenama u sastavu crijevnih mikroba i funkcionalnim putovima mikroba, posebno onima povezanima s metabolizmom PPA i/ili proizvodnjom PPA.
U ovoj studiji korišteni su transgenični miševi FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) koji prekomjerno eksprimiraju zeleni fluorescentni protein (GFP) pod kontrolom glia-specifičnog GFAP promotora, slijedeći smjernice Odbora za institucionalnu skrb i korištenje životinja Sveučilišta Centralne Floride (UCF-IACUC) (broj dozvole za korištenje životinja: PROTO202000002). Nakon odbijanja, miševi su pojedinačno smješteni u kaveze s 1-5 miševa svakog spola po kavezu. Miševi su hranjeni ad libitum ili pročišćenom kontrolnom prehranom (modificirana otvorena standardna prehrana, 16 kcal% masti) ili prehranom s dodatkom natrijevog propionata (modificirana otvorena standardna prehrana, 16 kcal% masti, koja sadrži 5000 ppm natrijevog propionata). Količina korištenog natrijevog propionata bila je ekvivalentna 5000 mg PFA/kg ukupne težine hrane. Ovo je najveća koncentracija PPA odobrena za upotrebu kao konzervans za hranu. Kako bi se pripremili za ovu studiju, roditeljski miševi hranjeni su objema vrstama hrane 4 tjedna prije parenja i nastavljeno je tijekom cijele trudnoće majke. Potomci miševa [22 miša, 9 kontrolnih (6 mužjaka, 3 ženke) i 13 PPA (4 mužjaka, 9 ženki)] su odbijeni od dojke, a zatim su nastavljeni na istoj prehrani kao i majke tijekom 5 mjeseci. Potomci miševa su žrtvovani u dobi od 5 mjeseci, a njihov crijevni sadržaj je prikupljen i u početku pohranjen u mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 ml na -20°C, a zatim prebačen u zamrzivač na -80°C dok se DNK domaćina nije iscrpila i nukleinske kiseline mikroba nisu ekstrahirane.
DNK domaćina uklonjena je prema modificiranom protokolu (Charalampous i sur., 2019.). Ukratko, sadržaj fekalija prenesen je u 500 µl InhibitEX-a (Qiagen, kat. br./ID: 19593) i pohranjen smrznut. Obradite maksimalno 1-2 fekalne pelete po ekstrakciji. Sadržaj fekalija zatim je mehanički homogeniziran pomoću plastičnog tučka unutar epruvete kako bi se formirala suspenzija. Centrifugirajte uzorke na 10 000 RCF tijekom 5 minuta ili dok se uzorci ne peletira, zatim aspirirajte supernatant i resuspendirajte pelet u 250 µl 1× PBS-a. Dodajte 250 µl 4,4%-tne otopine saponina (TCI, broj proizvoda S0019) uzorku kao deterdžent za labavljenje eukariotskih staničnih membrana. Uzorci su lagano miješani dok ne postanu glatki i inkubirani na sobnoj temperaturi tijekom 10 minuta. Zatim, kako bi se razbile eukariotske stanice, u uzorak je dodano 350 μl vode bez nukleaza, inkubirano 30 sekundi, a zatim je dodano 12 μl 5 M NaCl. Uzorci su zatim centrifugirani na 6000 RCF tijekom 5 minuta. Supernatant se aspirira i talog se resuspendira u 100 μl 1X PBS. Za uklanjanje DNA domaćina, doda se 100 μl HL-SAN pufera (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml vode bez nukleaza) i 10 μl HL-SAN enzima (ArticZymes P/N 70910-202). Uzorci su temeljito promiješani pipetiranjem i inkubirani na 37 °C tijekom 30 minuta pri 800 okretaja u minuti na Eppendorf™ ThermoMixer C. Nakon inkubacije, centrifugirani su na 6000 RCF tijekom 3 minute i isprani dva puta s 800 µl i 1000 µl 1X PBS-a. Na kraju, talog je resuspendiran u 100 µl 1X PBS-a.
Ukupna bakterijska DNA izolirana je pomoću New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kita (New England Biolabs, Ipswich, MA, kat. br. T3010L). Standardni operativni postupak koji se isporučuje s kompletom neznatno je modificiran. Inkubirajte i održavajte vodu bez nukleaza na 60 °C prije operacije za konačnu eluciju. Dodajte 10 µl Proteinaze K i 3 µl RNase A u svaki uzorak. Zatim dodajte 100 µl pufera za lizu stanica i lagano promiješajte. Uzorci su zatim inkubirani u Eppendorf™ ThermoMixeru C na 56 °C i 1400 rpm tijekom najmanje 1 sata, a najviše 3 sata. Inkubirani uzorci centrifugirani su pri 12 000 RCF tijekom 3 minute, a supernatant iz svakog uzorka prebačen je u zasebnu mikrocentrifugalnu epruvetu od 1,5 mL koja je sadržavala 400 µL otopine za vezanje. Epruvete su zatim pulsirajuće vrtložene 5-10 sekundi u intervalima od 1 sekunde. Prenesite cijeli tekući sadržaj svakog uzorka (približno 600–700 µL) u filter uložak smješten u protočnu epruvetu za sakupljanje. Epruvete su centrifugirane pri 1000 RCF tijekom 3 minute kako bi se omogućilo početno vezanje DNA, a zatim centrifugirane pri 12 000 RCF tijekom 1 minute kako bi se uklonila preostala tekućina. Kolona uzorka prenesena je u novu epruvetu za sakupljanje, a zatim isprana dva puta. Za prvo pranje, dodajte 500 µL pufera za pranje u svaku epruvetu. Okrenite epruvetu 3–5 puta, a zatim centrifugirajte pri 12 000 RCF tijekom 1 minute. Odbacite tekućinu iz epruvete za sakupljanje i vratite filter uložak u istu epruvetu za sakupljanje. Za drugo pranje, dodajte 500 µL pufera za pranje u filter bez okretanja. Uzorci su centrifugirani pri 12 000 RCF tijekom 1 minute. Prenesite filter u LoBind® epruvetu od 1,5 mL i dodajte 100 µL prethodno zagrijane vode bez nukleaza. Filteri su inkubirani na sobnoj temperaturi tijekom 1 minute, a zatim centrifugirani pri 12 000 RCF tijekom 1 minute. Eluirana DNA je pohranjena na -80 °C.
Koncentracija DNA kvantificirana je pomoću Qubit™ 4.0 fluorometra. DNA je pripremljena pomoću Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kita (kat. br. Q33231) prema uputama proizvođača. Raspodjela duljine fragmenata DNA mjerena je pomoću Aglient™ 4150 ili 4200 TapeStationa. DNA je pripremljena pomoću Agilent™ Genomic DNA Reagentsa (kat. br. 5067-5366) i Genomic DNA ScreenTapea (kat. br. 5067-5365). Priprema biblioteke provedena je pomoću Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kita (SQK-RPB004) prema uputama proizvođača. DNA je sekvencirana pomoću ONT GridION™ Mk1 sekvencera s Min106D protočnom ćelijom (R 9.4.1). Postavke sekvenciranja bile su: visoka točnost određivanja baza, minimalna q vrijednost od 9, postavljanje barkoda i obrezivanje barkoda. Uzorci su sekvencirani 72 sata, nakon čega su podaci o baznom pozivu poslani na daljnju obradu i analizu.
Bioinformatička obrada provedena je korištenjem prethodno opisanih metoda (Greenman i sur., 2024.). FASTQ datoteke dobivene sekvenciranjem podijeljene su u direktorije za svaki uzorak. Prije bioinformatičke analize, podaci su obrađeni korištenjem sljedećeg cjevovoda: prvo su FASTQ datoteke uzoraka spojene u jednu FASTQ datoteku. Zatim su očitanja kraća od 1000 bp filtrirana korištenjem Filtlonga v. 0.2.1, s jedinim promijenjenim parametrom –min_length 1000 (Wick, 2024.). Prije daljnjeg filtriranja, kvaliteta očitanja kontrolirana je korištenjem NanoPlota v. 1.41.3 sa sljedećim parametrima: –fastq –plots dot –N50 -o
Za taksonomsku klasifikaciju, očitanja i sastavljeni kontigi klasificirani su pomoću programa Kraken2 v. 2.1.2 (Wood i sur., 2019.). Generirajte izvješća i izlazne datoteke za očitanja i sklopove. Koristite opciju –use-names za analizu očitanja i sklopova. Opcije –gzip-compressed i –paired navedene su za segmente očitanja. Relativna brojnost taksona u metagenomima procijenjena je pomoću programa Bracken v. 2.8 (Lu i sur., 2017.). Prvo smo stvorili kmer bazu podataka koja sadrži 1000 baza koristeći bracken-build sa sljedećim parametrima: -d
Anotacija gena i procjena relativne abundancije provedeni su korištenjem modificirane verzije protokola koji su opisali Maranga i suradnici (Maranga i suradnici, 2023.). Prvo su kontigi kraći od 500 bp uklonjeni iz svih sklopova pomoću SeqKit v. 2.5.1 (Shen i suradnici, 2016.). Odabrani sklopovi zatim su kombinirani u pan-metagenom. Otvoreni okviri za čitanje (ORF) identificirani su korištenjem Prodigal v. 1.0.1 (paralelna verzija Prodigal v. 2.6.3) sa sljedećim parametrima: -d
Geni su prvo grupirani prema ortolognim (KO) identifikatorima Kyoto enciklopedije gena i genoma (KEGG) koje je dodijelio eggNOG radi usporedbe zastupljenosti genskih puteva. Geni bez knockouta ili geni s višestrukim knockoutima uklonjeni su prije analize. Zatim je izračunata prosječna zastupljenost svakog KO po uzorku i provedena je statistička analiza. Geni metabolizma PPA definirani su kao bilo koji gen kojem je dodijeljen redak ko00640 u stupcu KEGG_Pathway, što ukazuje na ulogu u metabolizmu propionata prema KEGG-u. Geni identificirani kao povezani s proizvodnjom PPA navedeni su u Dodatnoj tablici 1 (Reichardt i sur., 2014.; Yang i sur., 2017.). Permutacijski testovi provedeni su kako bi se identificirali geni metabolizma i proizvodnje PPA koji su bili značajno zastupljeniji u svakoj vrsti uzorka. Za svaki analizirani gen provedeno je tisuću permutacija. P-vrijednost od 0,05 korištena je kao granična vrijednost za određivanje statističke značajnosti. Funkcionalne napomene dodijeljene su pojedinačnim genima unutar klastera na temelju napomena reprezentativnih gena unutar klastera. Taksoni povezani s metabolizmom PPA i/ili proizvodnjom PPA mogli su se identificirati usklađivanjem ID-ova kontiga u izlaznim datotekama Kraken2 s istim ID-ovima kontiga zadržanim tijekom funkcionalne anotacije pomoću eggNOG-a. Testiranje značajnosti provedeno je pomoću Mann-Whitneyjevog U testa opisanog prethodno. Korekcija za višestruko testiranje provedena je pomoću Benjamini-Hochbergovog postupka. P-vrijednost ≤ 0,05 korištena je kao granična vrijednost za određivanje statističke značajnosti.
Raznolikost crijevnog mikrobioma miševa procijenjena je Simpsonovim indeksom raznolikosti. Nisu uočene značajne razlike između kontrolnih i PPA uzoraka u smislu raznolikosti roda i vrste (p-vrijednost za rod: 0,18, p-vrijednost za vrstu: 0,16) (Slika 1). Mikrobni sastav zatim je uspoređen analizom glavnih komponenti (PCA). Slika 2 prikazuje grupiranje uzoraka prema njihovim koljenima, što ukazuje na to da postoje razlike u sastavu vrsta mikrobioma između PPA i kontrolnih uzoraka. Ovo grupiranje bilo je manje izraženo na razini roda, što sugerira da PPA utječe na određene bakterije (Dopunska slika 1).
Slika 1. Alfa raznolikost rodova i sastav vrsta mišjeg crijevnog mikrobioma. Okvirni dijagrami prikazuju Simpsonove indekse raznolikosti rodova (A) i vrsta (B) u PPA i kontrolnim uzorcima. Značajnost je određena Mann-Whitneyjevim U testom, a višestruka korekcija provedena je Benjamini-Hochbergovim postupkom. ns, p-vrijednost nije bila značajna (p>0,05).
Slika 2. Rezultati analize glavnih komponenti sastava crijevnog mikrobioma miša na razini vrste. Grafikon analize glavnih komponenti prikazuje raspodjelu uzoraka po njihovim prve dvije glavne komponente. Boje označavaju vrstu uzorka: miševi izloženi PPA-u su ljubičasti, a kontrolni miševi žuti. Glavne komponente 1 i 2 prikazane su na x-osi i y-osi i izražene su kao njihov objašnjeni omjer varijance.
Korištenjem podataka transformiranih RLE-om, uočeno je značajno smanjenje medijana omjera Bacteroidetes/Bacilli u kontrolnoj skupini i PPA miševima (kontrola: 9,66, PPA: 3,02; p-vrijednost = 0,0011). Ova razlika je posljedica veće brojnosti Bacteroidetes u PPA miševima u usporedbi s kontrolnom skupinom, iako razlika nije bila značajna (prosječni CLR kontrole: 5,51, prosječni CLR PPA: 6,62; p-vrijednost = 0,054), dok je brojnost Bacteroidetes bila slična (prosječni CLR kontrole: 7,76, prosječni CLR PPA: 7,60; p-vrijednost = 0,18).
Analiza brojnosti taksonomskih članova crijevnog mikrobioma otkrila je da se 1 koljeno i 77 vrsta značajno razlikuju između PPA i kontrolnih uzoraka (Dodatna tablica 2). Brojnost 59 vrsta u PPA uzorcima bila je značajno veća nego u kontrolnim uzorcima, dok je brojnost samo 16 vrsta u kontrolnim uzorcima bila veća nego u PPA uzorcima (Slika 3).
Slika 3. Različita brojnost taksona u crijevnom mikrobiomu PPA i kontrolnih miševa. Vulkanski dijagrami prikazuju razlike u brojnosti rodova (A) ili vrsta (B) između PPA i kontrolnih uzoraka. Sive točke označavaju da nema značajne razlike u brojnosti taksona. Obojene točke označavaju značajne razlike u brojnosti (p-vrijednost ≤ 0,05). Prvih 20 taksona s najvećim razlikama u brojnosti između vrsta uzoraka prikazano je crvenom i svijetloplavom bojom (kontrolni i PPA uzorci). Žute i ljubičaste točke bile su najmanje 2,7 puta brojnije u kontrolnim ili PPA uzorcima nego u kontrolama. Crne točke predstavljaju taksone sa značajno različitom brojnošću, sa srednjim razlikama CLR-a između -1 i 1. P vrijednosti su izračunate pomoću Mann-Whitneyjevog U testa i korigirane za višestruko testiranje pomoću Benjamini-Hochbergovog postupka. Podebljane srednje razlike CLR-a označavaju značajne razlike u brojnosti.
Nakon analize sastava crijevne mikroflore, proveli smo funkcionalnu anotaciju mikrobioma. Nakon filtriranja gena niske kvalitete, u svim uzorcima identificirano je ukupno 378 355 jedinstvenih gena. Transformirana abundancija ovih gena korištena je za analizu glavnih komponenti (PCA), a rezultati su pokazali visok stupanj grupiranja tipova uzoraka na temelju njihovih funkcionalnih profila (Slika 4).
Slika 4. Rezultati PCA korištenjem funkcionalnog profila crijevnog mikrobioma miša. PCA dijagram prikazuje raspodjelu uzoraka po njihovim prve dvije glavne komponente. Boje označavaju vrstu uzorka: miševi izloženi PPA-u su ljubičasti, a kontrolni miševi žuti. Glavne komponente 1 i 2 prikazane su na x-osi i y-osi i izražene su kao njihov objašnjeni omjer varijance.
Zatim smo ispitali brojnost KEGG knockouta u različitim vrstama uzoraka. Ukupno je identificirano 3648 jedinstvenih knockouta, od kojih je 196 bilo značajno brojnije u kontrolnim uzorcima, a 106 u uzorcima PPA (Slika 5). Ukupno 145 gena otkriveno je u kontrolnim uzorcima, a 61 gen u uzorcima PPA, sa značajno različitim brojem. Putovi povezani s metabolizmom lipida i aminošećera bili su značajno bogatiji u uzorcima PPA (Dodatna tablica 3). Putovi povezani s metabolizmom dušika i sustavima releja sumpora bili su značajno bogatiji u kontrolnim uzorcima (Dodatna tablica 3). Brojnost gena povezanih s metabolizmom aminošećera/nukleotida (ko:K21279) i metabolizmom inozitol fosfata (ko:K07291) bila je značajno veća u uzorcima PPA (Slika 5). Kontrolni uzorci imali su značajno više gena povezanih s metabolizmom benzoata (ko:K22270), metabolizmom dušika (ko:K00368) i glikolizom/glukoneogenezom (ko:K00131) (Slika 5).
Sl. 5. Različita zastupljenost KO u crijevnom mikrobiomu PPA i kontrolnih miševa. Vulkanski dijagram prikazuje razlike u zastupljenosti funkcionalnih skupina (KO). Sive točke označavaju KO čija se zastupljenost nije značajno razlikovala između vrsta uzoraka (p-vrijednost > 0,05). Obojene točke označavaju značajne razlike u zastupljenosti (p-vrijednost ≤ 0,05). 20 KO s najvećim razlikama u zastupljenosti između vrsta uzoraka prikazano je crvenom i svijetloplavom bojom, što odgovara kontrolnim i PPA uzorcima. Žute i ljubičaste točke označavaju KO koji su bili najmanje 2,7 puta zastupljeniji u kontrolnim i PPA uzorcima. Crne točke označavaju KO sa značajno različitom zastupljenošću, sa srednjim razlikama CLR između -1 i 1. P vrijednosti su izračunate pomoću Mann-Whitneyjevog U testa i prilagođene za višestruke usporedbe pomoću Benjamini-Hochbergovog postupka. NaN označava da KO ne pripada putu u KEGG-u. Podebljane srednje vrijednosti razlike CLR označavaju značajne razlike u zastupljenosti. Za detaljne informacije o putovima kojima pripadaju navedeni KO, pogledajte Dodatnu tablicu 3.
Među označenim genima, 1601 gen imao je značajno različitu zastupljenost između tipova uzoraka (p ≤ 0,05), pri čemu je svaki gen bio najmanje 2,7 puta zastupljeniji. Od tih gena, 4 gena bila su zastupljenija u kontrolnim uzorcima, a 1597 gena u uzorcima PPA. Budući da PPA ima antimikrobna svojstva, ispitali smo zastupljenost gena metabolizma i proizvodnje PPA između tipova uzoraka. Među 1332 gena povezanih s metabolizmom PPA, 27 gena bilo je značajno zastupljenije u kontrolnim uzorcima, a 12 gena u uzorcima PPA. Među 223 gena povezana s proizvodnjom PPA, 1 gen bio je značajno zastupljeniji u uzorcima PPA. Slika 6A dodatno pokazuje veću zastupljenost gena uključenih u metabolizam PPA, sa značajno većom zastupljenošću u kontrolnim uzorcima i velikim veličinama učinka, dok slika 6B ističe pojedinačne gene sa značajno većom zastupljenošću uočenom u uzorcima PPA.
Sl. 6. Diferencijalna zastupljenost gena povezanih s PPA u crijevnom mikrobiomu miša. Vulkanski dijagrami prikazuju razlike u zastupljenosti gena povezanih s metabolizmom PPA (A) i proizvodnjom PPA (B). Sive točke označavaju gene čija se zastupljenost nije značajno razlikovala između vrsta uzoraka (p-vrijednost > 0,05). Obojene točke označavaju značajne razlike u zastupljenosti (p-vrijednost ≤ 0,05). 20 gena s najvećim razlikama u zastupljenosti prikazano je crvenom i svijetloplavom bojom (kontrolni i PPA uzorci). Zastupljenost žutih i ljubičastih točaka bila je najmanje 2,7 puta veća u kontrolnim i PPA uzorcima nego u kontrolnim uzorcima. Crne točke predstavljaju gene sa značajno različitom zastupljenošću, sa srednjim razlikama CLR između -1 i 1. P vrijednosti su izračunate pomoću Mann-Whitneyjevog U testa i korigirane za višestruke usporedbe pomoću Benjamini-Hochbergovog postupka. Geni odgovaraju reprezentativnim genima u katalogu neredundantnih gena. Imena gena sastoje se od simbola KEGG koji označava KO gen. Podebljane srednje razlike CLR označavaju značajno različite zastupljenosti. Crtica (-) označava da u KEGG bazi podataka ne postoji simbol za taj gen.
Taksoni s genima povezanim s metabolizmom i/ili proizvodnjom PPA identificirani su usklađivanjem taksonomskog identiteta kontiga s ID-om kontiga gena. Na razini roda, pronađeno je 130 rodova koji imaju gene povezane s metabolizmom PPA, a 61 rod koji ima gene povezane s proizvodnjom PPA (Dodatna tablica 4). Međutim, nijedan rod nije pokazao značajne razlike u brojnosti (p > 0,05).
Na razini vrste, pronađeno je 144 bakterijske vrste koje imaju gene povezane s metabolizmom PPA, a 68 bakterijskih vrsta ima gene povezane s proizvodnjom PPA (Dodatna tablica 5). Među metabolizatorima PPA, osam bakterija pokazalo je značajno povećanje brojnosti između vrsta uzoraka, a sve su pokazale značajne promjene u učinku (Dodatna tablica 6). Svi identificirani metabolizatori PPA sa značajnim razlikama u brojnosti bili su brojniji u uzorcima PPA. Klasifikacija na razini vrste otkrila je predstavnike rodova koji se nisu značajno razlikovali između vrsta uzoraka, uključujući nekoliko vrsta Bacteroides i Ruminococcus, kao i Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus i Alcaligenes polymorpha. Među bakterijama koje proizvode PPA, četiri bakterije pokazale su značajne razlike u brojnosti između vrsta uzoraka. Vrste sa značajnim razlikama u brojnosti uključivale su Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis i Ruminococcus bovis.
U ovoj studiji ispitali smo učinke izloženosti PPA na crijevnu mikrobiotu miševa. PPA može izazvati različite reakcije kod bakterija jer ga proizvode određene vrste, koriste ga druge vrste kao izvor hrane ili ima antimikrobne učinke. Stoga, njegovo dodavanje u crijevnu okolinu putem dodataka prehrani može imati različite učinke ovisno o toleranciji, osjetljivosti i sposobnosti korištenja kao izvora hranjivih tvari. Osjetljive bakterijske vrste mogu se eliminirati i zamijeniti onima koje su otpornije na PPA ili ga mogu koristiti kao izvor hrane, što dovodi do promjena u sastavu crijevne mikrobiote. Naši rezultati otkrili su značajne razlike u mikrobnom sastavu, ali ne i utjecaj na ukupnu mikrobnu raznolikost. Najveći učinci uočeni su na razini vrste, s preko 70 taksona koji se značajno razlikuju u brojnosti između uzoraka PPA i kontrolnih uzoraka (Dodatna tablica 2). Daljnja procjena sastava uzoraka izloženih PPA otkrila je veću heterogenost mikrobnih vrsta u usporedbi s neizloženim uzorcima, što sugerira da PPA može poboljšati karakteristike rasta bakterija i ograničiti bakterijske populacije koje mogu preživjeti u okruženjima bogatim PPA. Dakle, PPA može selektivno izazvati promjene, a ne uzrokovati rašireno narušavanje raznolikosti crijevne mikrobiote.
Prethodno je pokazano da konzervansi za hranu poput PPA mijenjaju brojnost komponenti crijevnog mikrobioma bez utjecaja na ukupnu raznolikost (Nagpal i sur., 2021.). Ovdje smo uočili najupečatljivije razlike između vrsta Bacteroidetes unutar koljena Bacteroidetes (ranije poznatih kao Bacteroidetes), koje su bile značajno obogaćene kod miševa izloženih PPA-u. Povećana brojnost vrsta Bacteroides povezana je s povećanom razgradnjom sluzi, što može povećati rizik od infekcije i potaknuti upalu (Cornick i sur., 2015.; Desai i sur., 2016.; Penzol i sur., 2019.). Jedna studija je otkrila da su neonatalni mužjaci miševa tretirani s Bacteroides fragilis pokazivali socijalno ponašanje koje podsjeća na poremećaj iz autističnog spektra (ASD) (Carmel i sur., 2023.), a druge studije su pokazale da vrste Bacteroides mogu promijeniti imunološku aktivnost i dovesti do autoimune upalne kardiomiopatije (Gil-Cruz i sur., 2019.). Vrste koje pripadaju rodovima Ruminococcus, Prevotella i Parabacteroides također su bile značajno povećane kod miševa izloženih PPA (Coretti i sur., 2018.). Određene vrste Ruminococcus povezane su s bolestima poput Crohnove bolesti proizvodnjom proinflamatornih citokina (Henke i sur., 2019.), dok su vrste Prevotella poput Prevotella humani povezane s metaboličkim bolestima poput hipertenzije i osjetljivosti na inzulin (Pedersen i sur., 2016.; Li i sur., 2017.). Konačno, otkrili smo da je omjer Bacteroidetes (ranije poznatih kao Firmicutes) i Bacteroidetes bio značajno niži kod miševa izloženih PPA nego kod kontrolnih miševa zbog veće ukupne brojnosti vrsta Bacteroidetes. Ovaj omjer se prethodno pokazao važnim pokazateljem crijevne homeostaze, a poremećaji u ovom omjeru povezani su s raznim bolesnim stanjima (Turpin i sur., 2016.; Takezawa i sur., 2021.; An i sur., 2023.), uključujući upalne bolesti crijeva (Stojanov i sur., 2020.). Zajedno, čini se da su vrste iz koljena Bacteroidetes najviše pogođene povišenim PPA u prehrani. To može biti zbog veće tolerancije na PPA ili sposobnosti korištenja PPA kao izvora energije, što se pokazalo istinitim za barem jednu vrstu, Hoylesella enocea (Hitch i sur., 2022.). Alternativno, izloženost majke PPA može poboljšati razvoj fetusa čineći crijeva mišjeg potomstva osjetljivijima na kolonizaciju Bacteroidetesima; međutim, naš dizajn studije nije dopustio takvu procjenu.
Metagenomska procjena sadržaja otkrila je značajne razlike u zastupljenosti gena povezanih s metabolizmom i proizvodnjom PPA, pri čemu su miševi izloženi PPA pokazali veću zastupljenost gena odgovornih za proizvodnju PPA, dok su miševi koji nisu bili izloženi PPA pokazali veću zastupljenost gena odgovornih za metabolizam PAA (Slika 6). Ovi rezultati sugeriraju da učinak PPA na mikrobni sastav možda nije isključivo posljedica njegove upotrebe, inače bi zastupljenost gena povezanih s metabolizmom PPA trebala pokazati veću zastupljenost u crijevnom mikrobiomu miševa izloženih PPA. Jedno objašnjenje je da PPA posreduje u zastupljenosti bakterija prvenstveno svojim antimikrobnim učincima, a ne svojom upotrebom od strane bakterija kao hranjive tvari. Prethodne studije pokazale su da PPA inhibira rast Salmonella Typhimurium na način ovisan o dozi (Jacobson i sur., 2018.). Izloženost višim koncentracijama PPA može odabrati bakterije koje su otporne na njegova antimikrobna svojstva i ne moraju nužno biti u stanju metabolizirati ga ili proizvoditi. Na primjer, nekoliko vrsta Parabacteroides pokazalo je značajno veću zastupljenost u uzorcima PPA, ali nisu otkriveni geni povezani s metabolizmom ili proizvodnjom PPA (Dodatne tablice 2, 4 i 5). Nadalje, proizvodnja PPA kao nusprodukta fermentacije široko je rasprostranjena među raznim bakterijama (Gonzalez-Garcia i sur., 2017.). Veća bakterijska raznolikost može biti razlog veće zastupljenosti gena povezanih s metabolizmom PPA u kontrolnim uzorcima (Averina i sur., 2020.). Nadalje, predviđeno je da su samo 27 (2,14%) od 1332 gena geni povezani isključivo s metabolizmom PPA. Mnogi geni povezani s metabolizmom PPA također su uključeni u druge metaboličke putove. To dodatno pokazuje da je zastupljenost gena uključenih u metabolizam PPA bila veća u kontrolnim uzorcima; ovi geni mogu funkcionirati u putovima koji ne rezultiraju iskorištavanjem ili stvaranjem PPA kao nusprodukta. U ovom slučaju, samo jedan gen povezan s stvaranjem PPA pokazao je značajne razlike u zastupljenosti između vrsta uzoraka. Za razliku od gena povezanih s metabolizmom PPA, marker geni za proizvodnju PPA odabrani su jer su izravno uključeni u bakterijski put za proizvodnju PPA. Kod miševa izloženih PPA, kod svih vrsta utvrđeno je značajno povećanje brojnosti i kapaciteta za proizvodnju PPA. To podupire predviđanje da će PPA odabrati proizvođače PPA i stoga predviđaju da će se kapacitet proizvodnje PPA povećati. Međutim, brojnost gena ne mora nužno korelirati s ekspresijom gena; stoga, iako je brojnost gena povezanih s metabolizmom PPA veća u kontrolnim uzorcima, stopa ekspresije može biti drugačija (Shi i sur., 2014.). Kako bi se potvrdila veza između prevalencije gena koji proizvode PPA i proizvodnje PPA, potrebna su istraživanja ekspresije gena uključenih u proizvodnju PPA.
Funkcionalna anotacija PPA i kontrolnih metagenoma otkrila je neke razlike. PCA analiza sadržaja gena otkrila je diskretne klastere između PPA i kontrolnih uzoraka (Slika 5). Grupiranje unutar uzorka otkrilo je da je sadržaj kontrolnih gena bio raznolikiji, dok su se PPA uzorci grupirali zajedno. Grupiranje prema sadržaju gena bilo je usporedivo s grupiranjem prema sastavu vrsta. Dakle, razlike u brojnosti putova u skladu su s promjenama u brojnosti specifičnih vrsta i sojeva unutar njih. U PPA uzorcima, dva puta sa značajno većom brojnošću bila su povezana s metabolizmom aminošećera/nukleotida šećera (ko:K21279) i višestrukim putovima metabolizma lipida (ko:K00647, ko:K03801; Dodatna tablica 3). Poznato je da su geni povezani s ko:K21279 povezani s rodom Bacteroides, jednim od rodova sa značajno većim brojem vrsta u PPA uzorcima. Ovaj enzim može izbjeći imunološki odgovor ekspresijom kapsularnih polisaharida (Wang i sur., 2008.). To bi moglo objasniti porast broja Bacteroidetes uočen kod miševa izloženih PPA-u. To nadopunjuje povećanu sintezu masnih kiselina uočenu u mikrobiomu PPA. Bakterije koriste put FASIIko:K00647 (fabB) za proizvodnju masnih kiselina, što može utjecati na metaboličke putove domaćina (Yao i Rock, 2015.; Johnson i sur., 2020.), a promjene u metabolizmu lipida mogu igrati ulogu u neurološkom razvoju (Yu i sur., 2020.). Drugi put koji pokazuje povećanu zastupljenost u uzorcima PPA bila je biosinteza steroidnih hormona (ko:K12343). Sve je više dokaza da postoji obrnuta veza između sposobnosti crijevne mikrobiote da utječe na razinu hormona i da na nju utječu hormoni, tako da povišene razine steroida mogu imati posljedice po zdravlje (Tetel i sur., 2018.).
Ova studija nije bez ograničenja i razmatranja. Važna razlika je da nismo proveli fiziološke procjene životinja. Stoga nije moguće izravno zaključiti jesu li promjene u mikrobiomu povezane s nekom bolešću. Drugo razmatranje je da su miševi u ovoj studiji hranjeni istom prehranom kao i njihove majke. Buća istraživanja mogla bi utvrditi poboljšava li prelazak s prehrane bogate PPA na prehranu bez PPA njezine učinke na mikrobiom. Jedno od ograničenja naše studije, kao i mnogih drugih, jest ograničena veličina uzorka. Iako se mogu izvući valjani zaključci, veći uzorak pružio bi veću statističku snagu pri analizi rezultata. Također smo oprezni u pogledu donošenja zaključaka o povezanosti između promjena u crijevnom mikrobiomu i bilo koje bolesti (Yap i sur., 2021.). Zbunjujući čimbenici, uključujući dob, spol i prehranu, mogu značajno utjecati na sastav mikroorganizama. Ti čimbenici mogu objasniti nedosljednosti uočene u literaturi u vezi s povezanošću crijevnog mikrobioma sa složenim bolestima (Johnson i sur., 2019.; Lagod i Naser, 2023.). Na primjer, pokazalo se da su članovi roda Bacteroidetes ili povećani ili smanjeni kod životinja i ljudi s ASD-om (Angelis i sur., 2013.; Kushak i sur., 2017.). Slično tome, studije sastava crijeva kod pacijenata s upalnim bolestima crijeva otkrile su i povećanja i smanjenja kod istih taksona (Walters i sur., 2014.; Forbes i sur., 2018.; Upadhyay i sur., 2023.). Kako bismo ograničili utjecaj spolne pristranosti, pokušali smo osigurati jednaku zastupljenost spolova tako da su razlike najvjerojatnije uzrokovane prehranom. Jedan od izazova funkcionalne anotacije je uklanjanje redundantnih genskih sekvenci. Naša metoda grupiranja gena zahtijeva 95% identiteta sekvence i 85% sličnosti duljine, kao i 90% pokrivenosti poravnanja kako bi se uklonilo lažno grupiranje. Međutim, u nekim slučajevima uočili smo COG-ove s istim anotacijama (npr. MUT) (slika 6). Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se utvrdilo jesu li ovi ortolozi različiti, povezani sa specifičnim rodovima ili je to ograničenje pristupa grupiranja gena. Još jedno ograničenje funkcionalne anotacije je potencijalna pogrešna klasifikacija; bakterijski gen mmdA poznati je enzim uključen u sintezu propionata, ali KEGG ga ne povezuje s metaboličkim putem propionata. Nasuprot tome, ortolozi scpB i mmcD su povezani. Veliki broj gena bez označenih nokauta može rezultirati nemogućnošću identifikacije gena povezanih s PPA pri procjeni brojnosti gena. Buća istraživanja će imati koristi od analize metatranskriptoma, koja može pružiti dublje razumijevanje funkcionalnih karakteristika crijevne mikrobiote i povezati ekspresiju gena s potencijalnim nizvodnim učincima. Za studije koje uključuju specifične neurološke razvojne poremećaje ili upalne bolesti crijeva, potrebne su fiziološke i bihevioralne procjene životinja kako bi se promjene u sastavu mikrobioma povezale s tim poremećajima. Dodatne studije transplantacije crijevnog mikrobioma u miševe bez klica također bi bile korisne kako bi se utvrdilo je li mikrobiom pokretač ili karakteristika bolesti.
Ukratko, pokazali smo da dijetalna PPA djeluje kao faktor u promjeni sastava crijevne mikrobiote. PPA je konzervans odobren od strane FDA, a široko se nalazi u raznim namirnicama, a dugotrajna izloženost može dovesti do poremećaja normalne crijevne flore. Otkrili smo promjene u brojnosti nekoliko bakterija, što sugerira da PPA može utjecati na sastav crijevne mikrobiote. Promjene u mikrobioti mogu dovesti do promjena u razinama određenih metaboličkih putova, što može dovesti do fizioloških promjena koje su relevantne za zdravlje domaćina. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se utvrdilo mogu li učinci dijetalne PPA na mikrobni sastav dovesti do disbioze ili drugih bolesti. Ova studija postavlja temelje za buduća istraživanja o tome kako učinci PPA na sastav crijeva mogu utjecati na ljudsko zdravlje.
Skupovi podataka predstavljeni u ovoj studiji dostupni su u online repozitorijima. Naziv repozitorija i pristupni broj su: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Ovu studiju na životinjama odobrio je Odbor za institucionalnu skrb i korištenje životinja Sveučilišta Centralne Floride (UCF-IACUC) (broj dozvole za korištenje životinja: PROTO202000002). Ova studija u skladu je s lokalnim zakonima, propisima i institucionalnim zahtjevima.
NG: Konceptualizacija, Kuriranje podataka, Formalna analiza, Istraživanje, Metodologija, Softver, Vizualizacija, Pisanje (izvorni nacrt), Pisanje (pregled i uređivanje). LA: Konceptualizacija, Kuriranje podataka, Metodologija, Resursi, Pisanje (pregled i uređivanje). SH: Formalna analiza, Softver, Pisanje (pregled i uređivanje). SA: Istraživanje, Pisanje (pregled i uređivanje). Glavni sudac: Istraživanje, Pisanje (pregled i uređivanje). SN: Konceptualizacija, Administracija projekta, Resursi, Nadzor, Pisanje (pregled i uređivanje). TA: Konceptualizacija, Administracija projekta, Nadzor, Pisanje (pregled i uređivanje).
Autori izjavljuju da nisu primili financijsku potporu za istraživanje, autorstvo i/ili objavljivanje ovog članka.
Autori izjavljuju da je istraživanje provedeno u odsutnosti ikakvih komercijalnih ili financijskih odnosa koji bi se mogli protumačiti kao potencijalni sukob interesa. nije primjenjivo.
Sva mišljenja iznesena u ovom članku isključivo su mišljenja autora i ne odražavaju nužno stavove njihovih institucija, izdavača, urednika ili recenzenata. Izdavač ne jamči niti podržava proizvode ocijenjene u ovom članku, ili bilo kakve tvrdnje njihovih proizvođača.
Dodatni materijal za ovaj članak možete pronaći na mreži: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propionska kiselina inducira gliozu i neuroinflamaciju reguliranjem PTEN/AKT puta kod poremećaja iz autističnog spektra. Znanstvena izvješća 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Statistička analiza podataka o sastavu. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Omjer Firmicutes/Bacteroidetes kao faktor rizika za rak dojke. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Analiza diferencijalne ekspresije podataka o brojanju sekvenci. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI i dr. (2013). Fekalna mikrobiota i metabolom u djece s autizmom i pervazivnim razvojnim poremećajem koji nije drugačije specificiran. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Bakterijske neurometaboličke karakteristike crijevne mikrobiote u male djece s poremećajima iz autističnog spektra. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiom kao ljudski organ. Klinička mikrobiologija i infekcija 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Novi uvidi u fiziologiju bakterija koje proizvode propionsku kiselinu: Anaerotignum propionicum i Anaerotignum neopropionicum (ranije Clostridium propionicum i Clostridium neopropionicum). Mikroorganizmi 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Prehrana majke i razvoj fetusa. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y. i Hochberg, J. (1995). Kontroliranje stope lažno pozitivnih rezultata: Praktičan i učinkovit pristup višestrukom testiranju. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Vrijeme objave: 18. travnja 2025.