Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Za razliku od kralježnjaka, smatra se da kukci nemaju spolne steroidne hormone koji su usmjereni na mužjake. Kod Anopheles gambiae, ekdizonski steroid 20-hidroksiekdizon (20E) čini se da je evoluirao kako bi kontrolirao razvoj jajašca kada ga sintetiziraju ženke2 i inducirao refraktorno razdoblje parenja kada ga mužjaci spolno prenose3. Budući da su razvoj jajašca i parenje bitne reproduktivne osobine, razumijevanje kako ženke komaraca Anopheles integriraju ove hormonske signale moglo bi olakšati dizajn novih programa za kontrolu malarije. Ovdje otkrivamo da su ove reproduktivne funkcije regulirane različitim spolnim steroidima putem složene mreže enzima koji aktiviraju/inaktiviraju ekdisteroide. Identificirali smo oksidirani ekdizon specifičan za mužjake, 3-dehidro-20E (3D20E), koji štiti roditeljstvo isključivanjem ženske spolne receptivnosti nakon spolnog prijenosa i aktivacije defosforilacijom. Značajno je da je prijenos 3D20E također inducirao ekspresiju reproduktivnih gena koji održavaju razvoj jajašca tijekom infekcije Plasmodiumom, osiguravajući zdravlje zaraženih ženki. Ženski 20E ne izaziva spolni odgovor, ali omogućuje jedinkama koje se pare da polažu jaja nakon što su inhibirane 20E-inhibirajuće kinaze. Identifikacija ovog muško-specifičnog insektnog steroidnog hormona i njegova uloga u regulaciji ženske spolne receptivnosti, plodnosti i interakcije s Plasmodiumom sugerira potencijal za smanjenje reproduktivnog uspjeha komaraca koji prenose malariju.
Slučajevi i smrtni slučajevi od malarije ponovno su u porastu4 zbog široko rasprostranjene otpornosti na insekticide kod komaraca Anopheles, jedinog vektora ljudskih parazita malarije. Biologija parenja ovih komaraca posebno je atraktivna meta za nove intervencije suzbijanja malarije jer se ženke pare samo jednom5; sterilnost ovog pojedinačnog parenja imala bi veliki potencijal za smanjenje populacija komaraca na terenu.
Žene postaju spolno onesposobljene nakon što prime visoke titre steroidnih hormona od muškaraca. Studije su pokazale da je okidač za poteškoće u daljnjem parenju 20-hidroksiekdizon (20E), steroidni hormon poznatiji kao regulator ciklusa mitarenja u larvalnoj fazi. Sposobnost mužjaka da sintetiziraju i prenose 20E evoluirala je specifično kod vrsta Anopheles koje su dio podroda Cellia7, koji je rasprostranjen u Africi i uključuje najopasnije vektore malarije, uključujući Anopheles gambiae. To je posebno značajno jer kod ovih vrsta ženke također proizvode 20E nakon svakog obroka krvi, a 20E pokreće ciklus oogeneze (vidi ref. 8). Međutim, malo se zna o načinu na koji ženke integriraju signale iz dva različita izvora ekdizona (prijenos mužjaka i indukcija hranjenja krvlju) bez ugrožavanja vlastite sposobnosti parenja. Zapravo, ako 20E koji proizvode ženke izazove spolnu netoleranciju, to će dovesti do neplodnosti kod jedinki koje se hrane djevičanskim životinjama, što je vrlo uobičajeno ponašanje kod ovih komaraca5.
Moguće objašnjenje je da mužjaci A. gambiae prenose modificirani ekdizon specifičan za mužjake, koji aktivira signalnu kaskadu u ženskom reproduktivnom traktu, što rezultira nestabilnošću parenja. Međutim, iako kralježnjaci imaju više steroidnih hormona, poput estrogena i androgena (pregledano u ref. 9), koliko znamo, androgeni steroidi nisu identificirani kod insekata.
Krenuli smo odrediti repertoar steroidnih hormona u muškoj pomoćnoj žlijezdi (MAG) spolno zrele A. gambiae u potrazi za mogućim modificirajućim steroidima. Korištenjem visokoučinkovite tekućinske kromatografije u kombinaciji s tandemskom masenom spektrometrijom (HPLC-MS/MS) umjesto manje specifične metode koja se prethodno koristila, otkrili smo ekdizon (E) i 20E u ovom tkivu, potvrđujući prethodni rezultat. Međutim, uzorkom su dominirali oksidirani fosforilirani steroidi, u skladu s formulom 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Slika 1). Drugi oblici uključuju 3-dehidro-20E (3D20E) i 20E-22-fosfat (20E22P). Intenzitet HPLC-MS/MS signala 3D20E22P bio je dva reda veličine veći od njegovog defosforiliranog oblika, 3D20E, i tri reda veličine veći od E i 20E (Slika 1). Iako su u drugim dijelovima tijela i donjem reproduktivnom traktu (LRT; Prošireni podaci, slika 1a). Također smo analizirali ekdisteroide u novozatvorenim (<1 dan starim) mužjacima i ženkama te otkrili 3D20E i 3D20E22P samo u MAG-u; E, 20E i 20E22P bili su prisutni u oba spola (Prošireni podaci, slika 1b). Ovi podaci upućuju na to da odrasli mužjaci A. gambiae proizvode visoke titre modificirajućih hormona u svojim MAG-ovima koje ženke ne sintetiziraju.
MAG i ženski LRT (uključujući atrije, sjemene mjehuriće i parovarij) secirani su od 4 dana starih (4 dana starih) djevičanskih mužjaka i djevičanskih i parenih ženki (0,5, 3 i 12 hpm). Ekdizon u tim tkivima analiziran je HPLC-MS/MS (srednja vrijednost ± sem; neparni t-test, dvostrani, korigiran za stopu lažnog otkrivanja (FDR); NS, nije značajno; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E: 3 sata vs. 0,5 sati, P = 0,035; 12 sati vs. 3 sata, P = 0,0015; 12 sati vs. 0,5 sati, P = 0,030. 3D20E22P: 3 sata vs. 0,5 sati, P = 0,25; 12 sati vs. 3 sata, P = 0,0032; 12 sati u odnosu na 0,5 sati, P = 0,015). Podaci su iz tri biološka ponavljanja. Površina vrha za svaki ekdizon od interesa izračunata je i normalizirana brojem komaraca. Ekdizon je predstavljen bojama kako slijedi: E, zelena; 20E, narančasta; 20E22P, ljubičasta; 3D20E, plava; 3D20E22P, ružičasta. Umetak povećava skalu na y-osi kako bi prikazao niže razine ekdizona.
Kako bismo istražili prenose li se 3D20E22P i 3D20E tijekom parenja, secirali smo ženske LRT-ove u različitim vremenskim točkama nakon parenja. Iako ekdizon nije pronađen u djevica, uočili smo značajne količine 3D20E22P u LRT-u odmah nakon parenja (0,5 h nakon parenja, hpm), koje su se s vremenom smanjivale, dok su se razine 3D20E značajno povećavale (slika 1). Koristeći kemijski sintetizirani 3D20E kao standard, utvrdili smo da su razine ovog steroidnog hormona u LRT-ovima tijekom parenja bile najmanje 100 puta veće od 20E (Tablica proširenih podataka 1). Dakle, 3D20E22P je glavni muški ekdizon koji se prenosi na ženski LRT tijekom parenja, a njegov defosforilirani oblik, 3D20E, postaje vrlo obilan ubrzo nakon parenja. To sugerira važnu ulogu potonjeg ekdizona u biologiji ženki nakon parenja.
Nakon generiranja novog skupa podataka za sekvenciranje RNA (RNA-seq) (slika 2a), koristeći prilagođeni bioinformatički cjevovod, tražili smo ekdizon kinazu (EcK), ekdizon oksidazu (EO) i ekdizon koji kodira 20E-modificirani gen fosfataze. EPP) se eksprimira u reproduktivnim tkivima. Identificirali smo jednog kandidata za EPP gen i dva potencijalna EcK gena (EcK1 i EcK2), ali nismo uspjeli pronaći dobrog kandidata za EO gen. Značajno je da su pojedinačni EPP geni eksprimirani u visokim razinama (98,9. percentil) u gambijskim MAG-ovima, ali ne i u ženskim LRT-ovima (slika 2b), suprotno našim očekivanjima budući da se defosforilacija 3D20E22P dogodila u ovom ženskom tkivu. Stoga vjerujemo da se muški EPP može prenijeti tijekom parenja. Doista, koristili smo in vivo označavanje stabilnim izotopima kako bismo maskirali ženski protein nakon parenja, enzim identificiran MS-om u ženskom atriju (slika 2c i dodatna tablica 1). Prisutnost EPP u MAG i parenim (ali ne djevičanskim) ženkama LRT također je potvrđen korištenjem specifičnih antitijela (slika 2d).
a, Prilagođeno izrađen bioinformatički cjevovod za pretraživanje reproduktivnih tkiva svakog spola za gene koji kodiraju EcK, EO i EPP. Brojevi pored strelica označavaju broj muških i ženskih kandidata u svakom koraku. Ova analiza identificirala je jedan EPP gen (EPP) i jedan EcK gen (EcK1) koji se eksprimiraju kod mužjaka, te jedan EcK gen (EcK2) koji se eksprimira kod oba spola, ali ne daje kandidatski EO gen.b, Heatmap koji uspoređuje ekspresiju kandidatskog gena u djevičanskom (V) i parenju (M) tkivu Anopheles gambiae i Anopheles albicans.Spca, oplodnja; MAG, pomoćne žlijezde kod mužjaka; drugi dijelovi tijela, uključujući grudi, krila, noge, masna tijela i unutarnje organe u oba spola, te jajnike u ženki. EcK2 je visoko eksprimiran i u MAG-u i u atrijima Gambije, dok se EPP nalazi samo u MAG-u.c, Proteomska analiza translokacije muške ejakulacijske skupine u ženske atrije u 3, 12 i 24 hpm, pokazujući 67 najzastupljenijih proteina. Ženke su uzgajane na prehrani koja sadrži 15N za označavanje (i maskiranje) svih proteina. Neoznačeni mužjaci pareni su s označenim ženkama, a ženske LRT-ove secirane su u 3, 12 i 24 hpm za proteomsku analizu (vidi Dodatnu tablicu 1 za potpuni popis ejakulacijskih proteina). Umetak, EPP, Eck1 i EcK2 otkriveni su u MAG-u djevičanskih mužjaka proteomskom analizom tih tkiva.d, EPP je otkriven Western blotom u MAG-u i LRT-u parenih ženki, ali ne u djevičanskim ženkama ili mužjacima ili ostatku ženskog tijela. Membrane su istovremeno ispitano s anti-aktinskim (kontrola punjenja) i anti-EPP antitijelima. Svi mužjaci su djevice. Pogledajte Dodatnu sliku 1 za podatke o izvoru gela. Western blot je proveden dva puta sa sličnim rezultatima.
Aktivnost ekdisteroidne fosfofosfataze EPP-a potvrđena je nakon inkubacije HPLC-MS/MS-om s 3D20E22P izoliranim iz MAG-a (Prošireni podaci, slika 2a). Nadalje, kada smo utišali EPP RNA-posredovanom interferencijom (RNAi), otkrili smo snažno smanjenje aktivnosti fosfataze u reproduktivnim tkivima ovih mužjaka (slika 3a), a ženke parene s mužjacima kojima je utišan EPP pokazale su značajno niži udio defosforiliranog 3D20E (slika 3b) unatoč djelomičnom utišavanju gena (Prošireni podaci, slika 2b,c). Nasuprot tome, nismo otkrili značajne promjene u omjeru 20E22P/20E kod istih komaraca, što bi moglo sugerirati da je enzim specifičan za 3D20E22P (slika 3b).
a, Smanjena aktivnost fosfataze u MAG-u uzrokovana utišavanjem EPP-a korištenjem kontrola s dvolančanom EPP RNA (dsEPP) ili dvolančanom GFP RNA (dsGFP). U svakom ponavljanju korišteno je dvadeset MAG skupova (P = 0,0046, parni t-test, dvostrani), predstavljenih odvojenim točkama.b, Ženke parene s mužjacima s utišanim EPP-om imale su značajno niži udio defosforiliranog 3D20E pri 3 hpm (P = 0,0043, nespareni t-test, dvostrani), dok razine 20E nisu bile pogođene (P = 0,063, nespareni). t-test, dvostrani). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna vrijednost iz tri skupine od 13, 16 i 19 ženki u svakoj.c, Ženke parene s mužjacima kojima je utišan EPP imale su značajno veće stope ponovnog parenja (P = 0,0002, Fisherov egzaktni test, dvostrani). Ženke su prvo bile prisiljene pariti se kako bi se osigurao njihov status parenja; Dva dana kasnije, kontaktirani su s drugim mužjacima koji su nosili transgenu spermu kako bi se procijenila stopa ponovnog parenja kvantitativnom PCR detekcijom transgena.d Ženke hranjene krvlju parene s mužjacima kojima je utišan EPP imale su značajno smanjenu plodnost (P < 0,0001; Mann-Whitneyjev test, dvostrani) i blago smanjen broj jaja (P = 0,088, Mann-Whitneyjev test, dvostrani), dok stopa mriještenja nije bila pogođena (P = 0,94, Fisherov egzaktni test, dvostrani). U svim panelima, n predstavlja broj biološki neovisnih uzoraka komaraca.NS, nije značajno.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Zatim smo procijenili je li defosforilacija ekdizona važna za izazivanje otpornosti na parenje kod ženki. Značajno je da su se ženke parene s mužjacima s osiromašenim EPP-om ponovno parile s mnogo većom učestalošću (44,9%) nego kontrolne ženke (10,4%) kada su bile izložene dodatnim (transgeničnim) mužjacima (slika 3c). Također smo primijetili značajno smanjenje plodnosti (slika 3d, lijevo) i blagi pad broja jaja koje su položile te ženke (slika 3d, sredina), dok postotak jaja koje su položile ženke (još jedan odgovor izazvan kod ženki parenjem) nije bio pogođen (slika 3d, desno). S obzirom na uočenu specifičnost EPP-a za 3D20E22P, ovi rezultati sugeriraju da aktivacija 3D20E putem EPP-a prenesenog tijekom parenja može imati važnu ulogu u isključivanju ženske receptivnosti za daljnje parenje, ponašanje koje se prethodno pripisivalo spolnom prijenosu 20E. Stoga, ovaj hormon specifičan za mužjake također snažno utječe na žensku plodnost.
Zatim smo usporedili aktivnosti 20E i 3D20E u eksperimentima injekcije u spolno zrelih djevica koristeći kemijski sintetizirani 3D20E (slika 4a-c) i komercijalno dostupan 20E. Uočili smo da je 3D20E bio značajno učinkovitiji od 20E u isključivanju osjetljivosti ženki na parenje pri obje koncentracije (slika 4d). Značajno je da je polovica fiziološke razine 3D20E u LRT-u (1066 pg nakon injekcije u odnosu na 2022 pg nakon parenja) izazvala udio refraktornih ženki koji je bio 20 puta veći od fiziološke razine 20E (361 pg nakon injekcije) 24 sata nakon injekcije pri najvišoj koncentraciji od 18 pg nakon parenja; Prošireni podaci (Tablica 1). Ovaj rezultat je u skladu s idejom da spolni prijenos 20E ne uzrokuje refraktorne periode parenja i dodatno ukazuje na 3D20E kao glavni čimbenik u osiguravanju odnosa roditelj-dijete. 3D20E je također bio značajno aktivniji od 20E u testovima polaganja jaja kod djevičanskih ženki (Sl. 4e), što sugerira da je normalna stopa polaganja jaja koju smo primijetili nakon djelomičnog utišavanja EPP-a bila posljedica prisutnosti rezidualne aktivnosti 3D20E koju još uvijek proizvode ženski faktori inducirani parenjem.
(a,b) 3D20E kemijski sintetiziran iz 20E (a) s vrlo visokom konverzijom/učinkovitošću (podaci prikazani kao srednja vrijednost ± standardna vrijednost iz tri neovisne reakcije sinteze) (b).c, Maseni spektar (donja polovica) točno odgovara ekdizonu pronađenom u parenim ženkama LRT (gornja polovica).d, U usporedbi s 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherov egzaktni test, dvostrani) i 10%-tnim etanolom (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherov egzaktni test, dvostrani), dok je 20E bio značajno veći od kontrole samo pri višim dozama (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisherov egzaktni test, dvostrani).e, Injekcija 3D20E značajno je inducirala veće stope mriještenja u djevičanskih ženki nego u kontrolama s 10% etanola (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisherov egzaktni test, dvostrani), dok je 20E u usporedbi s kontrolama samo pri višim dozama (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisherov egzaktni test, dvostrani). 3D20E je inducirao značajno veće stope mriještenja od 20E pri višim dozama (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisherov egzaktni test, dvostrani). U svim panelima, n predstavlja broj biološki neovisnih uzoraka komaraca. NS, nije značajno. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Podaci su iz tri replicira.
U prethodnim studijama utvrdili smo da spolni prijenos steroidnih hormona inducira ekspresiju MISO-a (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), ženskog reproduktivnog gena koji štiti ženke A. gambiae od infekcije P. falciparum. Zdravstveni troškovi uzrokovani 13, najsmrtonosnijim ljudskim parazitom malarije. S obzirom na važnost MISO-a za reproduktivnu sposobnost Anophelesa u područjima endemskim za malariju, odlučili smo utvrditi koji hormon 3D20E ili 20E pokreće ekspresiju ovog gena. Otkrili smo da, iako injekcija 20E specifično ili snažnije inducira neke nuklearne hormonske receptore (HR), poput HR3 i HR4, i tipične nizvodne steroidne ciljeve, poput yolkogenih gena Vg14, 15, 16, MISO je jače induciran 3D20E (Prošireni podaci, slika 3). Dakle, čini se da spolni prijenos ovog androgenog steroidnog hormona inducira mehanizme koji štite ženke od troškova koje predstavlja parazitska infekcija. Nadalje, 3D20E različito utječe na obje izoforme E receptor EcR, inducirajući EcR-A i potiskujući EcR-B, te snažnije aktivirajući druge gene koji induciraju parenje, uključujući HPX15, koji utječe na žensku plodnost. To bi moglo objasniti značajnu neplodnost uočenu kod ženki parenih s mužjacima s utišanim EPP-om (Prošireni podaci, slika 3). Ovi podaci sugeriraju postojanje nizvodnih puteva koje preferencijalno aktiviraju dva ekdizonska hormona koji mogu biti temelj spolno specifične funkcije.
Zatim smo testirali funkciju dvaju EcK gena identificiranih u našem bioinformatičkom cjevovodu. Utišavanje EcK1 ili EcK2 rezultiralo je značajnom smrtnošću kod mužjaka (Prošireni podaci, slika 4a), što sugerira da je fosforilacija ekdizona, a time i inaktivacija, važna za preživljavanje. Budući da je EcK2 eksprimiran na višim razinama od EcK1 i detektiran je u MAG-ovima proteomikom (slika 2b,c i dodatna tablica 2), validirali smo njegovu aktivnost ekdisteroidne kinaze inkubacijom s 20E, što je rezultiralo fosforilacijom 20E22P (Prošireni podaci, slika 2).4b). Kada smo koristili 3D20E kao supstrat, nismo mogli detektirati fosforilirani produkt 3D20E22P (Prošireni podaci, slika 4c), što sugerira da bi 20E, a ne 3D20E, mogao biti preferirana meta EcK2.
Prema našoj RNA-seq analizi, EcK2 je također bio visoko eksprimiran u LRT-u djevičanskih ženki, gdje je bio isključen nakon parenja (slika 2b). Potvrdili smo ove podatke i utvrdili da ekspresija EcK2 nije bila pod utjecajem hranjenja krvlju (Prošireni podaci, slika 5a). Proširujući naše početne MS eksperimente, utvrdili smo da je vrh 20E22P usko povezan s vrhom 20E (22-26 sati nakon obroka krvi; Prošireni podaci, slika 5b). Utišavanje EcK2 kod djevičanskih ženki rezultiralo je trostrukim povećanjem relativnog omjera 20E i 20E22P 26 sati nakon obroka krvi (Prošireni podaci, slike 2c i 5c), potvrđujući da EcK2 također fosforilira 20E kod ženki. Značajno je da su djevičanske ženke s osiromašenim EcK2 zadržale punu spolnu receptivnost (Prošireni podaci, slika 5d,e), što dodatno sugerira da proizvodnja 20E kod ženki ne inducira refraktorne periode parenja. Međutim, ove su ženke značajno povećane stope polaganja jaja u usporedbi s kontrolnom skupinom, s više od 30% djevica koje su položile jaja (Prošireni podaci, slika 5f). Ako su injekcije dvolančane Eck2 RNA (dsEcK2) provedene nakon hranjenja krvlju, mrijest se nije dogodio, u kojem trenutku je vrh 20E zbog gutanja krvi opao. Sveukupno, ovi rezultati podupiru model da 20E proizveden nakon sisanja krvi može izazvati mrijest, ali samo kada se blokada mrijesta (EcK2 i moguće drugi čimbenici) isključi parenjem. Ni injekcije 20E ni 3D20E nisu inhibirale ekspresiju EcK2 kod djevica (Prošireni podaci, slika 5g), što sugerira da drugi čimbenici posreduju u inhibiciji ove kinaze. Međutim, razine 20E nakon hranjenja krvlju nisu bile dovoljne da izazovu nelagodu parenja, već su ih učinkovito potaknuli visoki titri spolno prenesenog 3D20E.
Naši rezultati pružaju važan uvid u mehanizme koji reguliraju reproduktivni uspjeh A. gambiae. Pojavio se model u kojem su mužjaci evoluirali do sintetiziranja visokih titara 3D20E, muško-specifičnog modificiranog ekdizona koji osigurava roditeljstvo desenzibilizacijom ženki na daljnje parenje. Istodobno, ovi vektori malarije također su razvili učinkovit sustav za aktiviranje 3D20E kod ženki kao odgovor na spolni prijenos mužjački specifičnog EPP-a. Koliko znamo, ovo je prvi primjer steroidnog hormonskog sustava kojim dominiraju mužjaci i ženke, a koji obavlja jedinstvenu i kritičnu funkciju kod insekata. Funkcija muško-specifičnog ekdizona je postulirana, ali nije definitivno dokazana. Na primjer, uglavnom opovrgnuta hipoteza 18 je da te funkcije može obavljati prekursor 20E E1. Dobro je poznato da se kod Drosophile monandrija pokreće spolnim prijenosom malih spolnih peptida 19,20 koji stupaju u interakciju s neuronima koji inerviraju ženski reproduktivni trakt putem specifičnih receptora spolnih peptida 21,22. Potreban je daljnji rad kako bi se odredile nizvodne signalne kaskade. kontrolirano pomoću 3D20E kod ženki A. gambiae i utvrditi mogu li se te kaskade očuvati između komaraca i Drosophile.
S obzirom na važnu ulogu 3D20E na plodnost i ponašanje ženki identificiranu u našoj studiji, putevi koji vode do sinteze i aktivacije 3D20E nude nove mogućnosti za buduće strategije suzbijanja komaraca, poput stvaranja konkurentnih sterilnih mužjaka u strategijama sterilne tehnologije insekata koji se koriste za puštanje u divljinu ili za imitiranje 3D20E u igri s djevičanstvom. Funkcija 3D20E specifična za mužjake možda se razvila kada su A. gambiae i druge vrste Cellia stekle sposobnost koagulacije svoje sperme u čepove za parenje, jer to omogućuje učinkovit prijenos velikog broja hormona i enzima koji aktiviraju hormone. Zauzvrat, evolucija 3D20E koja implementira monandriju pruža mehanizam ženkama (kroz visoku ekspresiju MISO-a) da pogoduje njihovoj reproduktivnoj sposobnosti u područjima s visokom prevalencijom malarije, što neizravno doprinosi prijenosu Plasmodiuma. S obzirom na to da je pokazano da ženski 20E ima dubok utjecaj na preživljavanje i rast P. falciparum kod ženki komaraca Anopheles,24 i muški i ženski putevi steroidnih hormona sada su ključni aspekti interakcija komaraca i parazita.
Sojevi A. gambiae G3 uzgajani su u standardnim uvjetima za kukce (26-28 °C, 65-80% relativne vlažnosti, 12:12 h fotoperiod svjetla/tame). Ličinke su hranjene hranom za ribe u prahu (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets i Tetra Pond Sticks u omjeru 7:7:2). Odrasli komarci hranjeni su ad libitum 10%-tnom otopinom dekstroze i tjednom ljudskom krvlju (komponente krvi za proučavanje). Djevičanski komarci dobiveni su odvajanjem spolova u stadiju kukuljice nakon pregleda krajeva mikroskopijom. Mužjaci koji nose DsRed transgen prethodno su opisani.
Eksperimenti prisilnog parenja provedeni su prema prethodno opisanim protokolima. Za prirodno parenje, 4 dana stare djevičanske ženke držane su u omjeru 1:3 sa spolno zrelim djevičanskim mužjacima dvije noći. Za eksperimente u kojima su mužjacima injicirani dsEPP, zajednički smještaj u kavezu podudarao se s 3. i 4. danom nakon injekcije, kada je aktivnost fosfataze bila maksimalno utišana (Prošireni podaci, slika 2b).
Tkiva komaraca, preostali leševi (ostatak tijela) ili cijelo tijelo secirani su u 100%-tnom metanolu i homogenizirani pomoću kuglice (staklene kuglice od 2 mm, 2400 okretaja u minuti, 90 sekundi). Količine tkiva i volumeni metanola bili su sljedeći: ostatak tijela, 50 u 1000 µl; MAG, 50–100 po 80 µl; ženski LRT, 25–50 po 80 µl. Talog je podvrgnut drugoj ekstrakciji metanolom s istim volumenom metanola. Stanični ostaci uklonjeni su centrifugiranjem. Metanol iz obje ekstrakcije spojen je i osušen pod protokom dušika, a zatim resuspendiran u sljedećim volumenima 80% metanola u vodi: ostatak tijela, 50 µl; MAG i ženski LRT, 30 µl.
Uzorci su analizirani na masenom spektrometru (ID-X, Thermo Fisher) spojenom na LC instrument (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl uzorka je injektirano na kolonu od 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) održavanu na 25 °C. Mobilne faze za LC bile su A (voda, 0,1% mravlja kiselina) i B (acetonitril, 0,1% mravlja kiselina). LC gradijent je bio sljedeći: 5% B tijekom 1 minute, zatim povećan na 100% B tijekom 11 minuta. Nakon 8 minuta na 100%, kolona je ponovno uravnotežena na 5% B tijekom 4 minute. Brzina protoka bila je 0,3 ml min-1. Ionizacija u MS izvoru postiže se zagrijavanjem elektrosprej ionizacijom u pozitivnom i negativnom načinu rada.
Maseni spektrometar mjeri podatke u m/z rasponu od 350 do 680 pri rezoluciji od 60 000 u punom MS načinu rada. MS/MS podaci su prikupljeni na [M + H]+ (svi ciljevi), [M - H2O + H]+ (svi ciljevi) i [M - H]- (fosforilirani ciljevi). MS/MS podaci su korišteni za potvrdu ekdizonskih svojstava ciljeva za koje nije bio dostupan standard. Za identifikaciju neciljanih ekdisteroida, analizirani su MS/MS podaci za sve HPLC vrhove s relativnom abundancijom >15%. Kvantificirajte pomoću standardnih krivulja stvorenih iz čistih standarda (20E, 3D20E) za izračun apsolutnih količina ili razrjeđenja jednog specifičnog uzorka (svi ostali ciljevi) kako biste izračunali njihovu ekvivalentnost količinama pronađenim u jednom mužjaku. Za 3D20E, kvantifikacija je provedena korištenjem zbroja sljedećih adukata: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Podaci su ekstrahirani i kvantificirani pomoću Tracefindera (verzija 4.1). MS/MS podaci analizirani su pomoću Xcalibura (verzija 4.4). MS spektri E, 20E i 3D20E uspoređeni su s odgovarajućim standardima. 3D20E22P analiziran je derivatizacijom Girardovim reagensom. 20E22P analiziran je omjerom m/z.
3D20E22P je pročišćen iz MAG-a. Pročišćavanje je provedeno na analitičkoj skali korištenjem ultra-učinkovitog tekućinskog kromatografa (Acquity, Waters) s kvadrupolnim detektorom na bazi mase (QDa, Acquity, Waters) pod istim LC uvjetima kao i HPLC-MS/MS analiza. Sakupljanje frakcija je pokrenuto kada je m/z koji odgovara 3D20E22P detektiran u istom vremenu zadržavanja kao što je prethodno određeno. Čistoća ekstrahiranih spojeva je zatim provjerena HPLC-MS/MS-om kao što je gore opisano.
Ukupna RNA ekstrahirana je iz 10-12 reproduktivnih tkiva ili drugih dijelova tijela (bez glave) korištenjem TRI reagensa (Thermo Fisher) prema uputama proizvođača. RNA je tretirana s TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA je sintetizirana korištenjem reverzne transkriptaze Moloneyjevog virusa mišje leukemije (M-MLV RT; Thermo Fisher) prema uputama proizvođača. Primeri za kvantitativnu PCR s reverznom transkripcijom (RT-qPCR; Proširena tablica podataka 2) prethodno su objavljeni24 ili dizajnirani korištenjem Primer-BLAST26, s prednošću produktima veličine 70-150 bp koji obuhvaćaju spojeve egzon-egzon ili par primera koji odvajaju egzone. Uzorci cDNA iz tri do četiri biološka replikata razrijeđeni su četiri puta u vodi za RT-qPCR. Kvantifikacija je provedena u reakcijama replikata od 15 µl koje su sadržavale 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primere i 5 µl razrijeđene cDNA. Reakcije su provedene na QuantStudio 6 Pro sustavu za PCR u stvarnom vremenu (Thermo Fisher) i podaci su prikupljeni i analizirani korištenjem programa Design and Analysis (verzija 2.4.3). Kao što je pokazano u ovoj studiji, relativne količine su normalizirane na ribosomski gen RpL19 (AGAP004422), čija se ekspresija nije značajno mijenjala s hranjenjem krvlju 27 ili parenjem 3.
Kvaliteta RNA provjerena je pomoću Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer-a (Agilent). Illumina biblioteke sparenih krajeva pripremljene su i pokrenute na Broad Instituteu MIT-a i Harvarda. Sekvencirajući očitanja usklađena su s genomom A. gambiae (PEST soj, verzija 4.12) pomoću HISAT2 (verzija 2.0.5) s zadanim parametrima. Očitavanja s rezultatima kvalitete mapiranja (MAPQ) <30 uklonjena su pomoću Samtoolsa (verzija 1.3.1). Broj očitanja mapiranih na gene prebrojan je pomoću htseq-count (verzija 0.9.1) s zadanim parametrima. Izračunati su normalizirani brojevi očitanja, a diferencijalna ekspresija gena analizirana pomoću DESeq2 paketa (verzija 1.28.1) u R-u (verzija 4.0.3).
Kandidati za gene koji modificiraju ekdizon identificirani su prvo pretraživanjem genoma A. gambiae pomoću PSI-BLAST algoritma (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), korištenjem zadanih vrijednosti parametara sa sljedećim sekvencama upitnih proteina: iz Bombyx mori (pristupni broj NP_001038956.1), Musca domestica (pristupni broj XP_005182020.1, XP_005175332.1 i XP_011294434.1) i Microplitis demolitor (pristupni broj XP_008552646.1 i XP_008552645.1) EcK iz B. mori (pristupni broj NP_001036900), Drosophila melanogaster (pristupni broj NP_651202), Apis mellifera (pristupni broj XP_394838) i Acyrthosiphon pisum (pristupni broj XP_001947166); te EPP od B. mori (pristupni broj XP_001947166) NP_001177919.1 i NP_001243996.1) i EO od D. melanogaster (pristupni broj NP_572986.1) (korak 1). Zatim, filtrirajte pogotke na temelju visoke ekspresije mRNA (>100 fragmenata/kilobaznih eksona na milijun mapiranih očitanja (FPKM) ili >85%) u reproduktivnom tkivu (ženski LRT ili MAG) u Gambiji (korak 2). Kako bismo poboljšali specifičnost, odabrali smo kandidatske enzime koji se također eksprimiraju u reproduktivnom tkivu A. albimanus, vrste Anopheles koja ne sintetizira niti prenosi ekdizon tijekom parenja. Kandidatski geni filtrirani su na temelju niske ekspresije (<100 FPKM ili <85. percentil) u reproduktivnom tkivu A. albimanus (korak 3). Kao konačni filter (korak 4), kandidatski geni moraju zadovoljiti barem jedan od sljedećih uvjeta: (1) značajno pojačana ekspresija nakon parenja (P < 0,05) prema analizi različito eksprimiranih gena i (2) u nereproduktivnim tkivima (< 85 % ili <100 FPKM).
Modificirali smo prethodno opisane metode 28,29,30 kako bismo postigli izotopsko označavanje cijelog organizma. Ukratko, divlji tip Saccharomyces cerevisiae tipa II (YSC2, Sigma) testiran je u kvascu s dušikovom bazom (BD Difco, DF0335) koja sadrži (wt/vol) 2% glukoze (G7528, Sigma), 1,7% medija za kulturu bez aminokiselina i amonijev sulfat) i 5% 15N amonijev sulfat (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) kao jedini izvor dušika. Kvasac je izoliran centrifugiranjem, a ličinke komaraca hranjene su ad libitum do kukuljice. Dodatak je riblje brašno (0,5 mg na 300 ličinki) kako bi se spriječila smrtnost u četvrtom stadiju. Zatim su u eksperimentima parenja s neoznačenim mužjacima korištene samo ženke za analizu muškog proteoma prenesenog tijekom parenja.
Djevičanske ženke označene s 15N u dobi od 4-6 dana prisiljene su pariti se s neoznačenim djevičanskim mužjacima odgovarajuće dobi. Uspješno parenje potvrđeno je detekcijom parenja pod epifluorescentnom mikroskopijom. U 3, 12 i 24 sata u minuti, atriji 45-55 parenih ženki secirani su u 50 µl amonijevog bikarbonatnog pufera (pH 7,8) i homogenizirani tučkom. Homogenat je centrifugiran, a supernatant pomiješan s 50 µl 0,1% RapiGesta (186001860, Waters) u 50 mM amonijevog bikarbonata. Supernatant i talog iz svakog uzorka brzo su zamrznuti na suhom ledu i preko noći poslani u MacCoss laboratorij na Sveučilištu u Washingtonu, gdje je dovršena priprema uzorka za LC-MS/MS. Talog resuspendirajte u 50 µl 0,1% RapiGesta u 50 mM amonijevog bikarbonata i sonicirajte u vodenoj kupelji. Koncentracija proteina u talogu i supernatantu mjerena je BCA metodom. U testu, uzorci su reducirani s 5 mM ditiotreitola (DTT; Sigma), alkilirani s 15 mM jodoacetamida (Sigma) i inkubirani na 37 °C (1:0 50) tijekom 1 sata s omjerom tripsinizacije:tripsin:supstrat). RapiGest je liziran dodatkom 200 mM HCl, nakon čega je slijedila inkubacija na 37 °C tijekom 45 minuta i centrifugiranje pri 14 000 okretaja u minuti tijekom 10 minuta na 4 °C radi uklanjanja ostataka. Uzorci su isprani dvostrukom ekstrakcijom na čvrstoj fazi (Oasis MCX patrone, Waters) i resuspendirani u 0,1% mravljoj kiselini do konačne koncentracije proteina od 0,33 µg µl-1. Neobilježeni MAG proteomi su slično analizirani od djevičanskih mužjaka. Za svaki uzorak analizirana su dva analitička ponavljanja. Zatim je 1 µg svakog analiziran korištenjem 25 cm fuzionirane silicijeve kolone od 75 μm s 4 cm... Kasil1 (PQ) fritna hvataljka od taljenog silicijevog dioksida punjena Jupiter C12 reverzno-faznom smolom (Phenomenex) i 180-minutna tekućinska kromatografija. Digestija uzoraka – MS/MS je provedena na Q-Exactive HF masenom spektrometru (Thermo Fisher) s nanoACQUITY UPLC sustavom (Waters). Podaci o akviziciji generirani za svako mjerenje pretvoreni su u mzML format pomoću Proteowizarda (verzija 3.0.20287) i pomoću Comet31 (verzija 3.2) u odnosu na FASTA bazu podataka koja sadrži proteinske sekvence iz Anopheles gambiae (VectorBase verzija 54), Anopheles coluzzi. Pretraživanje je provedeno na Mali-NIH (VectorBase verzija 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, ožujak 2021.), A. gambiae RNA-seq i translacijama s tri okvira poznatih ljudskih onečišćujućih tvari. FDR-ovi usklađeni s peptidnom mapom određeni su pomoću Percolatora32 (verzija 3.05) s pragom od 0,01, a peptidi su sastavljeni u identifikacijske podatke proteina korištenjem parsimonije proteina u Limelightu33 (verzija 2.2.0). Relativna abundancija proteina procijenjena je korištenjem normaliziranog faktora spektralne abundancije (NSAF) izračunatog za svaki protein u svakom pokusu kako je prethodno opisano. NSAF u odnosu na svaki protein usrednjen je na uzorcima iz dva različita biološka ponavljanja. Označavanje s 15N uspješno je maskiralo ženski proteom, iako se mala količina neobilježenog proteina mogla detektirati iz označenih djevičanskih uzoraka. Zabilježili smo detekciju smanjenja muških proteina (1-5 spektri) u ženskim sirovim uzorcima samo u tehničkim pokusima, gdje su sirovi uzorci analizirani nakon muških/parećih uzoraka, kao rezultat HPLC "prijenosa". Povremeni proteini pronađeni kao "kontaminanti" iz označenih djevičanskih uzoraka navedeni su u Dodatnoj tablici 1.
Dva antigena peptida, QTTDRVAPAPDQQQ (unutar izotipa PA) i MESDGTTPSGDSEQ (unutar izotipa PA i PB) u Genscriptu. Dva peptida su kombinirana, zatim konjugirana s proteinskim nosačem KLH i injektirana u novozelandske zečeve. Zečevi su žrtvovani nakon četvrte injekcije, a ukupni IgG je izoliran afinitetnim pročišćavanjem. IgG iz zeca najspecifičnijeg za EPP korišten je za daljnji Western blotting.
Za Western blot, MAG (n = 10, gdje n predstavlja broj biološki neovisnih uzoraka komaraca) i ženke LRT (n = 30) od 4 dana starih djevičanskih mužjaka i djevičanskih ili prisilno parenih ženki (<10 nakon parenja), pufer za ekstrakciju proteina (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% natrijev deoksiholat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× koktel inhibitora proteaze (Roche)) dodan je odvojeno. Uzorci su homogenizirani odmah nakon disekcije s kuglicom (2 mm staklene kuglice, 2400 rpm, 90 sekundi). Netopljivi ostaci uklonjeni su centrifugiranjem na 20 000 g na 4 °C. Proteini su kvantificirani Bradfordovim testom (Bio-Rad). Zatim je 20 µg MAG proteina, 40 µg LRT proteina i 20 µg preostalog proteina denaturirano i odvojeno s 10% Bis-Tris NuPAGE korištenjem MOPS pufera. Proteini su preneseni na poliviniliden fluoridne membrane korištenjem iBlot2 sustava za prijenos (Thermo Fisher). Membrane su dva puta isprane u 1× PBS-T (0,1% Tween-20 u PBS-u), a zatim blokirane u Odyssey puferu za blokiranje (Li-Cor) tijekom 1 sata na 22°C. Membrane su tresene preko noći na 4°C s prilagođenim zečjim anti-EPP poliklonskim primarnim antitijelom (1:700 u puferu za blokiranje) i štakorskim anti-aktinskim monoklonskim primarnim antitijelom MAC237 (Abeam; 1:4000). Membrane su isprane s PBS-T, a zatim inkubirane sa sekundarnim antitijelima (magareće anti-zečje 800CW i kozje anti-štakorsko 680LT (Li-Cor), oba 1:20000) u puferu za blokiranje koji sadrži 0,01% SDS i 0,2% Tween-20 tijekom 1 sata na 22°C. Membrane su isprane s PBS-T. i snimljene skenerom Odyssey CLx. Slike su prikupljene i obrađene u programu Image Studio (verzija 5.2). Specifičan pojas koji odgovara izoformi EPP-RA (82 kDa) nije detektiran.
Kodirajuće regije EPP-a (kao izoforma AGAP002463-RB koja sadrži domenu histidin fosfataze, NCBI pretraga konzervirane domene 34) i EcK2 (AGAP002181) klonirane su u plazmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); primeri su navedeni u Tablici proširenih podataka 2. Osam GS4 linkera (u tandemu) umetnuto je prije C-terminalne 6xHis oznake konstrukta pET-21a(+)-EcK2. Rekombinantni proteini proizvedeni su korištenjem NEBExpress reakcije sinteze proteina E. coli bez stanica (New England BioLabs). Rekombinantni proteini pročišćeni su korištenjem NEBExpress Ni spin kolona (New England BioLabs). Kontrolni protein dihidrofolat reduktaze (DHFR) proizveden je korištenjem DNA predloška iz NEBExpress Cell-Free E. coli kompleta za sintezu proteina. Proteini su pohranjeni u 50% glicerolu u PBS-u na -20 °C do 3 mjeseca.
Fosfatazna aktivnost EPP-a i ekstrakata tkiva mjerena je pomoću 4-nitrofenil fosfata (pNPP; Sigma-Aldrich). Reakcijski pufer sadržavao je 25 mM Tris, 50 mM octene kiseline, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA i 1 mM DTT. Tkivo je homogenizirano u reakcijskom puferu, a stanični ostaci su uklonjeni centrifugiranjem. Reakciju je potrebno započeti dodavanjem enzima ili ekstrakta tkiva u reakcijski pufer koji sadrži 2,5 mg ml-1 pNPP. Reakcijska smjesa je inkubirana na sobnoj temperaturi u mraku, a količina pNP pretvorenog iz pNPP kvantificirana je mjerenjem apsorbancije na 405 nm u različitim vremenima.
Za in vitro EcK aktivnost, protein je inkubiran s 0,2 mg 20E ili 3D20E u 200 µl pufera (pH 7,5) koji sadrži 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP i 10 mM MgCl2 tijekom 2 sata na 27 °C. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 800 µl metanola, zatim ohlađena na -20 °C tijekom 1 sata, a zatim centrifugirana na 20 000 g tijekom 10 minuta na 4 °C. Supernatant je zatim analiziran HPLC-MS/MS. Kako bi se toplinski inaktivirali proteini korišteni u kontrolnoj skupini, proteini su inkubirani u 50% glicerolu u PBS-u tijekom 20 minuta na 95 °C.
Za in vitro EPP aktivnost, protein je inkubiran s 3D20E22P (ekvivalentno količini pronađenoj u 18 parova MAG, pročišćenih HPLC-MS/MS) u 100 µl pufera (pH 7,5) koji sadrži 25 mM Tris, 50 mM octene kiseline, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA i 1 mM DTT tijekom 3 sata na 27 °C. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 400 µl metanola i hlađena na -20 °C tijekom 1 sata, zatim centrifugirana na 20 000 g tijekom 10 minuta na 4 °C. Supernatant je analiziran HPLC-MS/MS.
PCR fragmenti za EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) i EcK2 (556 bp) amplificirani su iz cDNA pripremljene iz leševa komaraca miješanog spola bez glava. PCR fragment eGFP kontrole (495 bp) amplificiran je iz prethodno opisanog pCR2.1-eGFP; PCR primeri navedeni su u Proširenoj tablici podataka 2. PCR fragment je umetnut između invertiranih T7 promotora na plazmidu pL4440. Plazmidni konstrukti su dobiveni iz NEB 5-α kompetentne E. coli (New England Biolabs) i provjereni sekvenciranjem DNA prije upotrebe (vidi Dodatne podatke 1 za sekvencu umetka). Primeri koji se podudaraju s T7 promotorom (Proširena tablica podataka 2) korišteni su za amplifikaciju umetka iz plazmida temeljenog na pL4440. Veličina PCR produkta potvrđena je elektroforezom na agaroznom gelu. dsRNA je transkribirana iz PCR predložaka pomoću Megascript T7 transkripcijskog kompleta (Thermo Fisher) i pročišćena prema uputama proizvođača s prethodno opisanim modifikacijama.
Za injekciju dsRNA, 1380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ubrizgano je u koncentraciji od 10 ng nl-1 u toraks odraslih mužjaka ili ženki (Nanoject III, Drummond) unutar 1 dana nakon ekloze. Razine genske blokade određene su u najmanje tri biološka ponavljanja ekstrakcijom RNA, sintezom cDNA i RT-qPCR. Za injekciju ekdizona, 4 dana starim ili 6 dana starim djevičanskim ženkama hranjenim krvlju ubrizgano je 0,13, 0,21 ili 0,63 µg 20E ili 3D20E (Nanoject III, Drummond) u koncentracijama od 1,3, 2,1, ovisno o eksperimentalnom dizajnu ili 6,3 ng nl-1. Ubrizgati 100 nl 10% (vol/vol) etanola u vodi; 100 nl 3D20E22P u 10%-tnom etanolu (što je ekvivalentno 75% količine pronađene u paru MAG-ova). Komarci su nasumično raspoređeni u skupinu koja je primala injekciju.
Za testove mrijesta, trodnevne ženke su hranjene ad libitum ljudskom krvlju. Uklonite djelomično hranjene ili neuhranjene komarce. Ovisno o tretmanu, ženke su smještene u odvojene posude za mrijest četiri noći najmanje 48 sati nakon obroka krvi. Jaja su brojana pod stereoskopom (Stemi 508, Zeiss); kod parenih ženki, jaja koja su se izlegla u ličinke smatrana su oplođenim.
Za pokuse parenja, ženkama je dopušteno najmanje 2 dana, ovisno o tretmanu, da razviju otpornost na parenje, a mužjaci divljeg tipa odgovarajuće dobi naknadno su ubačeni u isti kavez. Dvije noći kasnije, oplođene vezikule ženki su secirane, a genomska DNA je oslobođena smrzavanjem-odmrzavanjem i sonikacijom u puferu koji sadrži 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA i 25 mM NaCl (pH 8,2). Uzorci su inkubirani s proteinazom K (0,86 µg µl-1) tijekom 15 minuta na 55 °C, a zatim 10 minuta na 95 °C. Pripreme sirove genomske DNA razrijeđene su 10 puta i podvrgnute qPCR detekciji sekvenci Y kromosoma; primeri su navedeni u proširenoj tablici podataka 2. Odsutnost sekvence Y kromosoma ukazuje na odsutnost parenja.
Za testove ponovnog parenja, prisilno parene ženke su pregledane na prisutnost parenja kako bi se potvrdio status parenja i ostavljena su im 2 dana da razviju refraktornost na parenje u odsutnosti mužjaka, kao što je prethodno opisano 36. Mužjaci koji su nosili DsRed transgenu spermu zatim su uneseni u kaveze ženki. Dvije noći kasnije, vezikule za oplodnju su secirane iz ženki, a genomska DNA je pripremljena kao što je gore opisano i podvrgnuta qPCR detekciji DsRed transgena; primeri su navedeni u proširenoj tablici podataka 2. Odsutnost DsRed transgena ukazivala je na to da nije došlo do ponovnog parenja.
3D20E je sintetiziran kako je prethodno opisano 37. Ukratko, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) otopljeno je u 10 ml vode, nakon čega je dodano 30 mg platinaste crne boje (u obliku praha, Sigma-Aldrich). Lagani mlaz O2 kontinuirano je propuštan u reakcijsku smjesu, koja je miješana na sobnoj temperaturi. Nakon 6 sati dodano je 30 mL metanola kako bi se zaustavila reakcija. Smjesa je centrifugirana kako bi se uklonile čestice katalizatora. Supernatant je uparen do suhog u vakuumu na sobnoj temperaturi. Osušeni reakcijski produkt otopljen je u 10%-tnom etanolu i metanolu za injekciju za HPLC-MS/MS analizu. Stopa konverzije (od 20E do 3D20E) bila je približno 97% (slika 4b), a MS spektar sintetiziranog 3D20E podudarao se s onim pronađenim kod parenih ženki (slika 4c).
Legenda sadrži specifične detalje provedenih statističkih testova. GraphPad (verzija 9.0) korišten je za provođenje Fisherovog egzaktnog testa, Mantel-Cox testa i Studentovog t-testa. Cochran-Mantel-Haenszel testovi provedeni su pomoću prilagođenog R skripta (dostupnog na https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Raspodjela podataka testirana je na normalnost pomoću Shapiro-Wilk testa s pragom značajnosti od 0,05. Kada podaci nisu prošli test normalnosti, proveden je Mann-Whitneyjev test. Podaci o preživljavanju analizirani su pomoću Mantel-Cox testa. DESeq2 paket (verzija 1.28.1) korišten je za provođenje analize diferencijalne ekspresije na razini gena RNA-seq. Horizontalna traka na grafu predstavlja medijan. Vrijednost značajnosti P = 0,05 korištena je kao prag za sve testove.
Za više informacija o dizajnu studije pogledajte sažetak izvješća o istraživanju prirode povezanog s ovim člankom.
Podaci MS proteomike pohranjeni su u ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) putem PRIDE Partner Repositoryja (https://www.ebi.ac.uk/pride/) s identifikatorom skupa podataka PXD032157.
Skup podataka RNA-seq pohranjen je u Sveobuhvatnoj knjižnici za ekspresiju gena (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) pod serijskim brojem GSE198665.
Dodatni skupovi podataka generirani i/ili analizirani tijekom tekuće studije mogu se dobiti od odgovarajućih autora na razuman zahtjev. Ovaj članak pruža izvorne podatke.
De Loof, A. Ekdisteroidi: Zanemareni spolni steroidi kukaca? Muško: Black Box. Znanost o kukcima. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiekdizon i razvoj jajnika kod Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).