Javascript je trenutno onemogućen u vašem pregledniku. Neke značajke ove web stranice neće raditi kada je javascript onemogućen.
Registrirajte se sa svojim specifičnim podacima i specifičnim lijekom koji vas zanima, a mi ćemo podatke koje navedete uskladiti s člancima u našoj opsežnoj bazi podataka i odmah vam poslati PDF kopiju e-poštom.
Granule Ban-Lan-Gen ublažavaju kronični recidivni kolitis izazvan dekstran natrijevim sulfatom kod miševa moduliranjem crijevne mikrobiote i obnavljanjem proizvodnje crijevnih SCFA izvedenih iz GLP-1
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Odjel za farmaciju Sveučilišne bolnice u Pekingu u Shenzhenu, Shenzhen, Narodna Republika Kina; 2Zdravstveni znanstveni centar Sveučilišta u Shenzhenu, Farmaceutski fakultet, Shenzhen, Narodna Republika Kina; 3Medicinski fakultet Sveučilišta u Guizhouu, Istraživački centar za inženjersku tehnologiju etničke medicine i tradicionalne kineske medicine, Razvoj i primjena Ministarstva obrazovanja, Ključni laboratorij za farmaciju pokrajine Guizhou, Medicinsko sveučilište Guizhou, Guiyang, Narodna Republika Kina; 4 Odjel za gastroenterologiju, Bolnica Sveučilišta u Pekingu u Shenzhenu, Shenzhen, Narodna Republika Kina; 5 Farmaceutski fakultet, Medicinsko sveučilište u Guizhouu, Državni ključni laboratorij za funkciju i primjenu ljekovitog bilja, Guiyang; 6 Odjel za laboratorijsku medicinu, Sveučilišna bolnica Shenzhen u Pekingu, Shenzhen, Kina [email protected] Shen Xiangchun, Farmaceutski fakultet, Medicinsko sveučilište Guizhou, Guizhou, Narodna Republika Kina, 550004, E-pošta [email protected] Cilj: Terapija temeljena na GLP-1 nova je mogućnost liječenja upalne bolesti crijeva. Granule Ban-Lan-Gen (BLG) poznata su antivirusna TCM formulacija koja pokazuje potencijalno protuupalno djelovanje u liječenju različitih upalnih stanja. Međutim, njegov protuupalni učinak na kolitis i mehanizam djelovanja još uvijek nisu jasni. METODE: Utvrditi kronični recidivirajući kolitis induciran dekstran natrijevim sulfatom (DSS) kod miševa. Indeksi aktivnosti bolesti, histološki markeri ozljede i razine proupalnih citokina provedeni su kako bi se procijenio zaštitni učinak BLG-a. Učinci BLG-a na crijevnu mikrobiotu i crijeva karakterizirani su razinama GLP-1 u serumu i ekspresijom Gcg, GPR41 i GRP43 u debelom crijevu, sastavom crijevne mikrobiote, razinama SCFA u stolici i oslobađanjem GLP-1 iz primarne stanice mišjeg kolonskog epitela, proizvodnja GLP-1 izvedenog iz SCFA. Rezultati: BLG tretman značajno je smanjio gubitak tjelesne težine, DAI, skraćivanje kolona, ​​oštećenje tkiva kolona i razine proinflamatornih citokina TNF-α, IL-1β i IL-6 u tkivu kolona. Osim toga, BLG tretman može značajno obnoviti ekspresiju kolonskog Gcg, GPR41 i GRP43 te razine GLP-1 u serumu kod miševa s kolitisom, te povećanjem bakterija koje proizvode SCFA poput Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001, te smanjenjem brojnosti bakterija poput Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas i Oscillibacter. Osim toga, BLG tretman može značajno povećati razinu SCFA u izmetu miševa s kolitisom. Istovremeno, in vitro eksperimenti također su pokazali da fekalni ekstrakt miševa tretiranih BLG-om može uvelike stimulirati primarne male mišje stanice kolonskog epitela koje luče GLP-1. Zaključci: Ovi nalazi upućuju na to da BLG ima antikolitični učinak. BLG ima potencijal za razvoj kao terapije, barem djelomično moduliranjem crijevne mikrobiote i obnavljanjem proizvodnje GLP-1 izvedenih iz crijevnih SCFA. Obećavajući lijekovi za kronični recidivni kolitis. Ključne riječi: kolitis, Ban-Lan-Gen granule, crijevna mikrobiota, kratkolančane masne kiseline, GLP-1
Ulcerozni kolitis (UK) je dugotrajna upalna bolest debelog crijeva i rektuma koju karakteriziraju ponavljajući proljevi, bolovi u trbuhu, gubitak težine i mukopurulentna krvava stolica.1 Nedavno je prevalencija UK-a porasla u zemljama s prethodno niskom incidencijom, uključujući Kinu, s rastućom popularnošću zapadnog načina života.2 Ovo povećanje predstavlja velike probleme za javno zdravstvo i ima ozbiljne implikacije na radnu sposobnost pacijenata i kvalitetu života. Važno je napomenuti da patogeneza UK-a ostaje uglavnom nejasna, ali općeprihvaćeno je da genetika, čimbenici okoliša, crijevna mikrobiota i imunološki sustav doprinose razvoju UK-a.3 Čak ni sada ne postoji lijek za UK, a cilj liječenja je klinički kontrolirati kliničke simptome, izazvati i održavati remisiju, potaknuti zacjeljivanje sluznice i smanjiti recidiv. Klasični tretmani uključuju aminosalicilate, kortikosteroide, imunosupresive i biološke lijekove. Međutim, ovi lijekovi ne mogu postići željeni učinak zbog različitih nuspojava.4 Nedavno su mnoge studije slučaja pokazale da je tradicionalna kineska medicina (TCM) pokazala veliki potencijal u ublažavanju UK-a. s niskom toksičnošću, što sugerira da je razvoj novih TCM terapija obećavajuća strategija liječenja ulceroznog kolitisa.5-7
Banlangen granule (BLG) su pripravak tradicionalne kineske medicine napravljen od vodenog ekstrakta korijena Banlangen.8 Osim antivirusne učinkovitosti, BLG pokazuje potencijalnu protuupalnu aktivnost u liječenju različitih upalnih stanja.9,10 Osim toga, glukozinolati (R,S-goitrin, progoitrin, epiprorubin i glukozid) izolirani su i identificirani iz vodenih ekstrakata Radix isatidis) i nukleozidi (hipoksantin, adenozin, uridin i gvanozin) te indigo alkaloidi poput indiga i indirubina.11,12 Prethodne studije su dobro dokumentirale da spojevi adenozin, uridin i indirubin pokazuju snažne antikolitične učinke u različitim životinjskim modelima kolitisa.13-17 Međutim, nisu provedene studije temeljene na dokazima za procjenu učinkovitosti BLG-a kod kolitisa. U ovoj studiji istražili smo zaštitni učinak BLG-a na kronični recidivni kolitis induciran dekstran natrijevim sulfatom (DSS) kod miševa C57BL/6 i otkrili da oralna primjena BLG značajno ublažava DSS-induciranu kroničnu recidivnu upalu debelog crijeva kod miševa, njezini regulatorni mehanizmi povezani su s modulacijom crijevne mikrobiote i obnavljanjem proizvodnje glukagonu sličnog peptida-1 (GLP-1) izvedenog iz crijeva.
BLG granule (bez šećera, odobrene od strane NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Peking, Kina; broj serije: 20110966) kupljene su u ljekarnama. DSS (molekularna težina: 36 000–50 000 daltona) kupljen je od MP Biologicals (Santa Ana, SAD). Sulfasalazin (SASP) (čistoća ≥ 98%), hematoksilin i eozin kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Mišji TNF-α, IL-1β i IL-6 luminex Elisa testovi kupljeni su od R&D systems (Minneapolis, MN, SAD). Octena kiselina, propionska kiselina i maslačna kiselina kupljene su od Aladdin Industries (Šangaj, Kina). 2-Etilmaslačna kiselina kupljena je od Merck KGaA (Darmstadt, Njemačka).
Mužjaci miševa C57BL/6 u dobi od 6-8 tjedana (tjelesne težine 18-22 g) kupljeni su od tvrtke Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Peking, Kina) i smješteni u okruženju od 22 ± 2 °C s 12-satnim ciklusom svjetlo/tama. Miševi su hranjeni standardnom prehranom za glodavce sa slobodnim pristupom vodi za piće tijekom jednog tjedna kako bi se aklimatizirali na novo okruženje. Miševi su zatim nasumično podijeljeni u četiri skupine: kontrolna skupina, DSS modelna skupina, skupina tretirana SASP-om (200 mg/kg, oralno) i skupina tretirana BLG-om (1 g/kg, oralno). Kao što je prikazano na slici 1A, prema našoj prethodnoj studiji, eksperimentalni kronični recidivirajući kolitis izazvan je kod miševa s tri ciklusa 1,8% DSS-a tijekom 5 dana, nakon čega je slijedila destilirana voda tijekom 7 dana, prema našoj prethodnoj studiji.18 Miševi u skupinama tretiranim SASP-om i BLG-om tretirani su SASP-om i BLG-om svaki dan počevši od 0. dana. Prema preliminarnim eksperimentima, doza BLG-a bila je postavljeno na 1 g/kg. U međuvremenu, doza SASP-a postavljena je na 200 mg/kg prema literaturi.4 Kontrolna i DSS modelna skupina primale su isti volumen vode tijekom cijelog eksperimenta.
Slika 1 BLG ublažava kronični recidivni kolitis induciran DSS-om u miševa. (A) Eksperimentalni dizajn kroničnog rekurentnog kolitisa i liječenje, (B) promjena tjelesne težine, (C) rezultat indeksa aktivnosti bolesti (DAI), (D) duljina debelog crijeva, (E) reprezentativna slika debelog crijeva, (F) H&E bojenje debelog crijeva (uvećanje, ×100) i (G) histološki rezultat. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 6).##p < 0,01 ili ###p < 0,001 u odnosu na kontrolnu (Con) skupinu; *p < 0,05 ili **p < 0,01 ili ***p < 0,001 u odnosu na DSS skupinu.
Tjelesna težina, konzistencija stolice i rektalno krvarenje bilježeni su svakodnevno. Indeks aktivnosti bolesti (DAI) određen je kombiniranjem rezultata tjelesne težine, konzistencije stolice i rektalnog krvarenja kao što je prethodno opisano.19 Na kraju eksperimenta, svi miševi su eutanazirani, a krv, izmet i debelo crijevo prikupljeni su za daljnje eksperimente.
Tkivo debelog crijeva fiksirano je formalinom i ugrađeno u parafin. Napravljeni su rezovi od 5 mikrona i obojeni hematoksilin-eozinom (H&E), zatim zaslijepljeni i bodovani kako je prethodno opisano.19
Ukupna RNA tkiva debelog crijeva ekstrahirana je Trizol reagensom (Invitrogen, Carlsbad, CA), nakon čega je slijedila ekstrakcija cDNA reverznom transkriptazom (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japan). Kvantitativna PCR provedena je korištenjem PCR sustava u stvarnom vremenu sa SYBR Green Masterom (Roche, Basel, Švicarska). Transkripti ciljnih gena normalizirani su na β-aktin, a podaci su analizirani korištenjem 2-ΔΔCT metode. Sekvence primera gena prikazane su u Tablici 1.
Primarna izolacija i kultura stanica mišjeg kolonskog epitela provedene su kako je prethodno opisano.20 Ukratko, kolon miševa starih 6-8 tjedana prvo je izrezan nakon žrtvovanja cervikalnom dislokacijom, zatim uzdužno otvoren, tretiran Hanksovom uravnoteženom otopinom soli (HBSS, bez kalcija i magnezija) i izrezan na male komadiće debljine 0,5-1 mm. Nakon toga, tkiva su probavljena s 0,4 mg/mL kolagenaze XI (Sigma, Poole, UK) u slobodnom DMEM mediju i centrifugirana pri 300 xg tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Talog se resuspendira u DMEM mediju (dopunjenom s 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 jedinica/mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina) na 37 °C i propusti kroz najlonsku mrežicu (veličina pora ~250 µm). Alikvoti stanica kolonskog epitela stavljeni su u posudice sa staklenim dnom i inkubirani s octenom kiselinom, propionskom kiselinom, maslačnom kiselinom i ekstraktima mišjeg fekalija tijekom 2 sata na 37°C, 5% CO2.
Tkivo debelog crijeva homogenizirano je s PBS-om, a razine citokina IL-6, TNF-α i IL-1β u tkivu debelog crijeva detektirane su pomoću luminex ELISA test kitova (R&D systems, Minneapolis, MN, SAD). Slično tome, razine GLP-1 u serumu i mediju za kulturu primarnih mišjih epitelnih stanica debelog crijeva određene su ELISA kitom (Bioswamp, Wuhan, Kina) prema uputama proizvođača.
Ukupna DNK iz fecesa ekstrahirana je pomoću kita za ekstrakciju DNK (Tiangen, Kina). Kvaliteta i količina DNK mjerene su pri omjerima 260 nm/280 nm i 260 nm/230 nm. Nakon toga, korištenjem svake ekstrahirane DNK kao predloška, ​​specifični primeri 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) i 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) korišteni su za amplifikaciju V3-V4 regija gena 16S rRNA u različitim regijama. PCR produkti pročišćeni su pomoću QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Njemačka), kvantificirani PCR-om u stvarnom vremenu i sekvencirani pomoću platforme za sekvenciranje IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, SAD). Za bioinformatičku analizu, obrada podataka provedena je prema prethodno objavljenim protokolima.21,22 Ukratko, upotrijebite Cutadapt (V1.9.1) za filtriranje sirovih ekspresnih datoteka. OTU-ovi su klasterirani pomoću UPARSE (verzija 7.0.1001) s graničnom vrijednosti sličnosti od 97%, a UCHIME je korišten za uklanjanje himernih sekvenci. Analiza sastava zajednice i klasifikacija provedene su pomoću RDP klasifikatora (http://rdp.cme.msu.edu/) na temelju SILVA baze podataka gena ribosomske RNA.
Razine kratkolančanih masnih kiselina (octena kiselina, propionska kiselina i maslačna kiselina) mjerene su kako je prethodno opisano od strane Tao i suradnika, uz neke izmjene.23 Ukratko, 100 mg fekalija prvo je suspendirano u 0,4 mL deionizirane vode, zatim u 0,1 mL 50%-tne sumporne kiseline i 0,5 mL 2-etilmaslačne kiseline (unutarnji standard), zatim homogenizirano i zagrijano na 4°C. Centrifugirajte pri 12 000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta na 50°C. Supernatant je ekstrahiran s 0,5 mL etera i ubrizgan u GC za analizu. Za analizu plinskom kromatografijom (GC), uzorci su analizirani pomoću plinskog kromatografa GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) opremljenog detektorom ionizacije plamena (FID). Separacija je postignuta korištenjem kolone ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Kina). Podaci su prikupljeni korištenjem GC softvera za otopine (Shimadzu, Inc.). Omjer podjele bio je 10:1, plin nosač bio je dušik, a brzina protoka 6 mL/min. Volumen ubrizgavanja bio je 1 μL. Temperatura injektora i detektora bila je 300°C. Temperatura pećnice održavana je na 140°C tijekom 13,5 minuta, a zatim povećana na 250°C brzinom od 120°C/min; temperatura se održavala 5 minuta.
Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna pogreška srednje vrijednosti (SEM). Značajnost podataka procijenjena je jednosmjernom ANOVA-om nakon čega je uslijedio Duncanov test višestrukog raspona. Za sve izračune korišten je GraphPad Prism 5.0 softver (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SAD), a p < 0,05 smatrano je statistički značajnim.
Dobro je poznato da je UC kronična recidivirajuća bolest kolitisa s jakim bolovima u trbuhu, proljevom i krvarenjem. Stoga je DSS-inducirani kronični recidivirajući kolitis kod miševa utvrđen kako bi se procijenila učinkovitost BLG-a protiv kolitisa (slika 1A). U usporedbi s kontrolnom skupinom, miševi u DSS modelnoj skupini imali su značajno smanjenu tjelesnu težinu i viši DAI, a te su promjene značajno poništene nakon 24 dana liječenja BLG-om (slika 1B i C). Skraćivanje debelog crijeva važan je znak UC-a. Kao što je prikazano na slikama 1D i E, duljine debelog crijeva miševa koji su primili DSS bile su značajno skraćene, ali su ublažene liječenjem BLG-om. Naknadno je provedena histopatološka analiza kako bi se procijenila upala debelog crijeva. H&E obojene slike i patološki rezultati pokazali su da je primjena DSS-a značajno poremetila arhitekturu debelog crijeva i rezultirala uništavanjem kripti, dok je liječenje BLG-om značajno smanjilo uništavanje kripti i patološke rezultate (slika 1F i G). Značajno je da je zaštitni učinak BLG-a u dozi od 1 g/Kg bio usporediv s onim SASP-a u dozi od od 200 mg/kg. Zajedno, ovi nalazi upućuju na to da je BLG učinkovit u smanjenju težine kroničnog recidivnog kolitisa izazvanog DSS-om kod miševa.
TNF-α, IL-1β i IL-6 važni su upalni markeri upale debelog crijeva. Kao što je prikazano na slici 2A, DSS je izazvao značajno povećanje ekspresije gena TNF-α, IL-1β i IL-6 u debelom crijevu u usporedbi s kontrolnom skupinom. Primjena BLG-a može značajno preokrenuti ove promjene posredovane DSS-om. Zatim smo koristili ELISA test za određivanje razina upalnih citokina TNF-α, IL-1β i IL-6 u tkivu debelog crijeva. Rezultati su također pokazali da su razine TNF-α, IL-1β i IL-6 u debelom crijevu bile značajno povećane kod miševa tretiranih DSS-om, dok je liječenje BLG-om ublažilo ta povećanja (slika 2B).
Slika 2 BLG inhibira ekspresiju gena i proizvodnju proinflamatornih citokina TNF-α, IL-1β i IL-6 u debelom crijevu miševa tretiranih DSS-om. (A) Ekspresija gena TNF-α, IL-1β i IL-6 u debelom crijevu; (B) razine proteina TNF-α, IL-1β i IL-6 u debelom crijevu. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 ili ##p < 0,01 ili ###p < 0,001 u odnosu na kontrolnu (Con) skupinu; *p < 0,05 ili **p < 0,01 u odnosu na DSS skupinu.
Crijevna disbioza je ključna u patogenezi UC-a.24 Kako bi se istražilo modulira li BLG crijevnu mikrobiotu miševa tretiranih DSS-om, provedeno je sekvenciranje 16S rRNA kako bi se analizirala bakterijska zajednica crijevnog sadržaja. Vennov dijagram pokazuje da tri skupine dijele 385 OTU-a. Istovremeno, svaka skupina imala je jedinstvene OTU-e (slika 3A). Nadalje, Chao1 indeks i Shannon indeks prikazani na slici 3B i C pokazali su da je raznolikost zajednice crijevne mikrobiote smanjena kod miševa tretiranih BLG-om, budući da je Shannon indeks značajno smanjen u skupini tretiranoj BLG-om. Analiza glavnih komponenti (PCA) i analiza glavnih koordinata (PCoA) korištene su za određivanje obrazaca grupiranja među tri skupine i pokazale su da je struktura zajednice miševa tretiranih DSS-om jasno odvojena nakon tretmana BLG-om (slika 3D i E). Ovi podaci sugeriraju da je tretman BLG-om značajno utjecao na strukturu zajednice miševa s kolitisom induciranim DSS-om.
Slika 3 BLG mijenja raznolikost crijevne mikrobiote u miševa s kolitisom induciranim DSS-om. (A) Vennov dijagram OTU-a, (B) Chao1 indeks, (C) Shannonov indeks bogatstva, (D) Grafik rezultata analize glavnih komponenti (PCA) OTU-a, (E) Slika rezultata analize glavnih koordinata (PCoA) OTU-a. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 6).**p < 0,01 u odnosu na DSS skupinu.
Kako bismo procijenili specifične promjene u fekalnoj mikrobioti, analizirali smo sastav crijevne mikrobiote na svim taksonomskim razinama. Kao što je prikazano na slici 4A, glavni koljeni u svim skupinama bili su Firmicutes i Bacteroidetes, a zatim Verrucomicrobia. Relativna brojnost Firmicutes i omjera Firmicutes/Bacteroidetes značajno su se povećali u fekalnim mikrobnim zajednicama miševa tretiranih DSS-om u usporedbi s kontrolnim miševima, a te su se promjene značajno poništile nakon tretmana BLG-om. Konkretno, tretman BLG-om značajno je povećao relativnu brojnost Verrucobacterium u izmetu miševa s kolitisom induciranim DSS-om. Na razini kućanstva, fekalne mikrobne zajednice zauzimale su Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae i Prevotellaceae (slika 4B). U usporedbi s DSS skupinom, smanjenje BLG-a povećalo je brojnost Akkermansiaceae, ali smanjilo brojnost Lachnospiraceae i Ruminococcaceae. Značajno je da je na razini roda Fekalnu mikrobiotu su zauzele Lachnospira_NK4A136_grupa, Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001 (slika 4C). Ovo otkriće je također pokazalo da je BLG tretman učinkovito preokrenuo neravnotežu mikrobiote kao odgovor na DSS izazov, što je karakterizirano smanjenjem Eubacterium_xylanophilum_grupe, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas i Oscillibacter, te povećanjem Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001.
Slika 4 BLG mijenja brojnost crijevne mikrobiote u miševa s DSS-induciranim kolitisom. (A) Brojnost crijevne mikrobiote na razini koljena; (B) Brojnost crijevne mikrobiote na razini porodice; (C) Brojnost crijevne mikrobiote na razini roda. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 6). #p < 0,05 ili ###p < 0,001 u odnosu na kontrolnu (Con) skupinu; *p < 0,05 ili **p < 0,01 ili ***p < 0,001 u odnosu na DSS skupinu.
S obzirom na to da su kratkolančane masne kiseline (SCFA) glavni metaboliti Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001, dok su acetat, propionat i butirat najzastupljenije SCFA u crijevnom lumenu, 25-27 još uvijek smo u našoj studiji. Kao što je prikazano na slici 5, koncentracije acetata, propionata i butirata u stolici bile su značajno smanjene u skupini tretiranoj DSS-om, dok je tretman BLG-om mogao uvelike suzbiti ovo smanjenje.
Slika 5. BLG povećava razinu SCFA u izmetu miševa s kolitisom induciranim DSS-om. (A) Sadržaj octene kiseline u izmetu; (B) sadržaj propionske kiseline u izmetu; (C) sadržaj maslačne kiseline u izmetu. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 6). #p < 0,05 ili ##p < 0,01 u odnosu na kontrolnu (Con) skupinu; *p < 0,05 ili **p < 0,01 u odnosu na DSS skupinu.
Nadalje smo izračunali Pearsonov koeficijent korelacije između diferencijalnih SCFA na razini roda i fekalne mikrobiote. Kao što je prikazano na slici 6, Akkermansia je bila pozitivno korelirana s proizvodnjom propionske kiseline (Pearson = 0,4866) i maslačne kiseline (Pearson = 0,6192). Nasuprot tome, i Enteromonas i Oscillobacter bili su negativno povezani s proizvodnjom acetata, s Pearsonovim koeficijentima od 0,4709 odnosno 0,5104. Slično tome, Ruminococcaceae_UCG-014 je bio negativno koreliran s proizvodnjom propionske kiseline (Pearson = 0,4508) i maslačne kiseline (Pearson = 0,5842).
Slika 6 Pearsonova korelacijska analiza između diferencijalnih SCFA i mikroba debelog crijeva. (A) Enteromonas s octenom kiselinom; (B) Bacil potresa mozga s octenom kiselinom; (C) Akkermansia vs. propionska kiselina; (D) Ruminococcus_UCG-014 s propionskom kiselinom; (E) Akkermansia s maslačnom kiselinom; (F) Ruminococcus _UCG-014 s maslačnom kiselinom.
Glukagonu sličan peptid-1 (GLP-1) je stanično-specifični posttranslacijski produkt proglukagona (Gcg) s protuupalnim svojstvima.28 Kao što je prikazano na slici 7, DSS je izazvao značajno smanjenje ekspresije Gcg mRNA. Liječenje debelog crijeva i BLG-a moglo je značajno preokrenuti smanjenje Gcg inducirano DSS-om u usporedbi s kontrolnom skupinom (slika 7A). Istodobno, razina GLP-1 u serumu bila je značajno smanjena u skupini tretiranoj DSS-om, a liječenje BLG-om moglo je uvelike spriječiti to smanjenje (slika 7B). Budući da masne kiseline kratkog lanca mogu stimulirati lučenje GLP-1 putem aktivacije receptora 43 vezanog na G-protein (GRP43) i receptora 41 vezanog na G-protein (GRP41), također smo ispitali GPR41 i GRP43 u debelom crijevu miševa s kolitisom i otkrili da je ekspresija GRP43 i GPR41 mRNA u debelom crijevu značajno smanjena nakon izazivanja DSS-om, a liječenje BLG-om moglo bi učinkovito spasiti ta smanjenja (slika 7C i D).
Slika 7 BLG povećava razinu GLP-1 u serumu i ekspresiju mRNA Gcg, GPR41 i GRP43 u debelom crijevu kod miševa tretiranih DSS-om. (A) Ekspresija mRNA Gcg u tkivu debelog crijeva; (B) Razina GLP-1 u serumu; (C) Ekspresija mRNA GPR41 u tkivu debelog crijeva; (D) Ekspresija mRNA GPR43 u tkivu debelog crijeva. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 ili ##p < 0,01 u odnosu na kontrolnu (Con) skupinu; *p < 0,05 u odnosu na DSS skupinu.
Budući da tretman BLG-om može povećati razinu GLP-1 u serumu, ekspresiju mRNA Gcg u debelom crijevu i razinu SCFA u stolici miševa tretiranih DSS-om, dalje smo ispitali acetat, propionat i butirat, kao i kod kontrolnih (F-Con), DSS kolitisa (F-Con) -DSS) i BLG-tretiranih miševa s kolitisom (F-BLG) na oslobađanje GLP-1 iz primarnih mišjih epitelnih stanica debelog crijeva. Kao što je prikazano na slici 8A, primarne mišje epitelne stanice debelog crijeva tretirane s 2 mM octenom kiselinom, propionskom kiselinom i maslačnom kiselinom značajno su stimulirale oslobađanje GLP-1, što je u skladu s prethodnim studijama.29,30 Slično tome, svi F-Con, F-DSS i F-BLG (ekvivalentno 0,25 g fekalija) uvelike su stimulirali oslobađanje GLP-1 iz primarnih mišjih epitelnih stanica debelog crijeva. Značajno je da je količina GLP-1 oslobođena od primarnih mišjih epitelnih stanica debelog crijeva tretiranih F-DSS-om bila mnogo niža od one kod primarnih miševa tretiranih F-Con i F-BLG-om. stanice debelog crijeva (Slika 8B). Ovi podaci upućuju na to da je BLG tretman značajno obnovio proizvodnju GLP-1 izvedenog iz crijevnih SCFA.
Slika 8 SCFA dobivene iz BLG-a stimuliraju oslobađanje GLP-1 iz primarnih mišjih epitelnih stanica debelog crijeva. (A) Octena kiselina, propionska kiselina i maslačna kiselina stimulirale su oslobađanje GLP-1 iz primarnih mišjih epitelnih stanica debelog crijeva; (B) fekalni ekstrakti F-Con, F-DSS i F-BLG stimulirali su primarne mišje epitelne stanice debelog crijeva Količina oslobođenog GLP-1. Alikvoti kolonskih epitelnih stanica stavljeni su u Petrijeve zdjelice sa staklenim dnom i tretirani s 2 mM octenom kiselinom, propionskom kiselinom, maslačnom kiselinom i fekalnim ekstraktima F-Con, F-DSS i F-BLG (ekvivalentno 0,25 g fecesa). 2 sata na 37°C, 5% CO2. Količina GLP-1 oslobođenog iz primarnih mišjih epitelnih stanica debelog crijeva detektirana je ELISA testom. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n = 3). #p < 0,05 ili ##p < 0,01 u odnosu na slijepu probu ili F-Con; *p < 0,05 u odnosu na F-DSS.
Kratice: Ace, octena kiselina; Pro, propionska kiselina; međutim, maslačna kiselina; F-Con, fekalni ekstrakt kontrolnih miševa; F-DSS, fekalni ekstrakt miševa s kolitisom; F-BLG, iz debelog crijeva tretiranog BLG-om. Fekalni ekstrakti upalnih miševa.
Svjetska zdravstvena organizacija uvrstila ga je na popis refraktornih bolesti, a ulcerozni kolitis postaje globalna opasnost; Međutim, učinkovite metode za predviđanje, sprječavanje i liječenje bolesti još su uvijek ograničene. Stoga postoji hitna potreba za istraživanjem i razvojem novih sigurnih i učinkovitih terapijskih strategija za ulcerozni kolitis. Pripravci tradicionalne kineske medicine obećavajuća su opcija jer se mnogi pripravci tradicionalne kineske medicine pokazali učinkovitima u liječenju ulceroznog kolitisa u kineskoj populaciji tijekom stoljeća, a svi su to biološki organski i prirodni materijali koji su uglavnom bezopasni za ljude i životinje.31,32 Cilj ove studije bio je pronaći siguran i učinkovit pripravak tradicionalne kineske medicine za liječenje ulceroznog kolitisa i istražiti njegov mehanizam djelovanja. BLG je dobro poznata kineska biljna formula koja se koristi za liječenje gripe.8,33 Rad u našem i drugim laboratorijima pokazao je da indigo, prerađeni proizvod tradicionalne kineske medicine od iste sirovine kao i BLG, pokazuje značajnu učinkovitost u liječenju ulceroznog kolitisa kod ljudi i životinja.4,34 Međutim, antikolitisni učinci BLG-a i njegov mehanizam djelovanja nisu jasni. U trenutnoj studiji naši rezultati pokazuju da BLG učinkovito ublažava upalu debelog crijeva izazvanu DSS-om, koja je povezana s modulacijom crijevne mikrobiote. i obnova proizvodnje GLP-1 iz crijeva.
Dobro je poznato da UC karakteriziraju razdoblja recidiva s tipičnim kliničkim značajkama, poput gubitka težine, proljeva, rektalnog krvarenja i opsežnog oštećenja sluznice debelog crijeva.35 Stoga je kronični recidivirajući kolitis primijenjen primjenom tri ciklusa 1,8% DSS-a tijekom pet dana, nakon čega je slijedilo sedam dana pijenja vode. Kao što je prikazano na slici 1B, fluktuirajući gubitak težine i DAI rezultati ukazivali su na uspješnu indukciju kroničnog recidivirajućeg kolitisa. Miševi u skupini liječenoj BLG-om pokazali su oporavak od 8. dana, što se značajno razlikovalo od 24. dana. Iste promjene uočene su i u DAI rezultatu, što sugerira poboljšanje kliničkog poboljšanja kolitisa. Što se tiče ozljede debelog crijeva i upalnog statusa, duljina debelog crijeva, oštećenje tkiva debelog crijeva te ekspresija gena i proizvodnja proinflamatornih citokina TNF-α, IL-1β i IL-6 u tkivu debelog crijeva također su se znatno poboljšali nakon liječenja BLG-om. Zajedno, ovi rezultati jasno pokazuju da je BLG učinkovit u liječenju kroničnog recidivirajućeg kolitisa kod miševa.
Kako BLG ostvaruje svoje farmakološke učinke? Brojne prethodne studije pokazale su da crijevna mikrobiota igra ključnu ulogu u patogenezi ulceroznog kolitisa (UK), a terapije temeljene na mikrobiomu i usmjerene na mikrobiom pojavile su se kao vrlo atraktivna strategija za liječenje UK. U ovoj studiji pokazali smo da je liječenje BLG-om rezultiralo značajnim promjenama u sastavu crijevne mikrobiote, što sugerira da je zaštitni učinak BLG-a protiv kolitisa induciranog DSS-om povezan s modulacijom crijevne mikrobiote. Ovo opažanje u skladu je s idejom da je reprogramiranje homeostaze crijevne mikrobiote važan pristup razumijevanju učinkovitosti TCM pripravaka.36,37 Posebno je važno napomenuti da je Akkermansia gram-negativna i strogo anaerobna bakterija koja živi u sloju sluzi crijeva, koja razgrađuje mucine, proizvodi propionsku kiselinu, stimulira diferencijaciju vrčastih stanica i održava funkciju integriteta barijere sluznice.26 Višestruki klinički i životinjski podaci sugeriraju da je Akkermansia u velikoj mjeri povezana sa zdravom sluznicom,38 a oralna primjena Akkermansia spp. može značajno poboljšati upalu sluznice.39 Naši trenutni podaci sugeriraju da se relativna brojnost Akkermansie značajno povećava nakon tretmana BLG-om. Osim toga, Prevotellaceae_UCG-001 je bakterija koja proizvodi SCFA.27 Višestruke studije pokazale su da je Prevotellaceae_UCG-001 pronađen u niskoj relativnoj brojnosti u izmetu životinja s kolitisom.40,41 Naši trenutni podaci također pokazuju da tretman BLG-om može značajno povećati relativnu brojnost Prevotellaceae_UCG-001 u debelom crijevu miševa tretiranih DSS-om. Nasuprot tome, Oscillibacter je mezofilna, strogo anaerobna bakterija.42 izvijestio je da je relativna brojnost Oscillibactera značajno povećana kod UC miševa i da je značajno pozitivno korelirala s razinama IL-6 i IL-1β te patološkim rezultatima.43,44 Važno je napomenuti da je tretman BLG-om značajno smanjio relativnu brojnost Oscillibactera u izmetu miševa tretiranih DSS-om. Važno je napomenuti da su ove BLG-om promijenjene bakterije bile bakterije koje su najviše proizvodile SCFA. Brojne prethodne studije pokazale su potencijalne blagotvorne učinke SCFA. na upalu debelog crijeva i zaštitu integriteta crijevnog epitela.45,46 Naši sadašnji podaci također su uočili da su koncentracije SCFA acetata, propionata i butirata u izmetu tretiranom DSS-om bile znatno povećane kod miševa tretiranih BLG-om. Uzeti zajedno, ovi nalazi jasno pokazuju da BLG tretman može učinkovito pojačati bakterije koje proizvode SCFA inducirane DSS-om kod miševa s kroničnim recidivnim kolitisom.
GLP-1 je inkretin koji se uglavnom proizvodi u ileumu i debelom crijevu te igra važnu ulogu u odgađanju pražnjenja želuca i snižavanju postprandijalne glukoze u krvi.47 Dokazi upućuju na to da dipeptidil peptidaza (DPP)-4, agonist GLP-1 receptora i GLP-1 nanomedicina mogu učinkovito ublažiti upalu crijeva kod miševa.48-51 Kao što je objavljeno u prethodnim studijama, visoke koncentracije SCFA bile su povezane s razinama GLP-1 u plazmi kod ljudi i miševa.52 Naši trenutni podaci pokazuju da su nakon tretmana BLG-om, razine GLP-1 u serumu i ekspresija Gcg mRNA značajno povećane. Slično tome, lučenje GLP-1 značajno je povećano u kulturama debelog crijeva nakon stimulacije fekalnim ekstraktima miševa s kolitisom tretiranih BLG-om u usporedbi sa stimulacijom fekalnim ekstraktima miševa s kolitisom tretiranih DSS-om. Kako SCFA utječu na oslobađanje GLP-1?Gwen Tolhurst i sur. izvijestili su da SCFA mogu stimulirati lučenje GLP-1 putem GRP43 i GPR41.29 Naši sadašnji podaci također pokazuju da tretman BLG-om značajno povećava ekspresiju mRNA GRP43 i GPR41 u debelom crijevu miševa tretiranih DSS-om. Ovi podaci sugeriraju da tretman BLG-om može obnoviti proizvodnju GLP-1 potaknutu SCFA-om aktiviranjem GRP43 i GPR41.
BLG je dugotrajni lijek koji se izdaje bez recepta (OTC) u Kini. Maksimalna podnošljiva doza BLG-a kod miševa iz Kunminga je 80 g/kg, a nije uočena akutna toksičnost.53 Trenutno je preporučena doza BLG-a (bez šećera) kod ljudi 9-15 g/dan (3 puta dnevno). Naša studija pokazala je da BLG u dozi od 1 g/kg ublažava kronični recidivni kolitis izazvan DSS-om kod miševa. Ova doza je blizu doze BLG-a koja se klinički koristi. Naša studija je također otkrila da je njegov mehanizam djelovanja posredovan, barem djelomično, promjenama u crijevnoj mikrobioti, posebno bakterijama koje proizvode SCFA, poput Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001, kako bi se obnovila proizvodnja GLP-1 iz crijeva. Ovi nalazi sugeriraju da BLG zaslužuje daljnje razmatranje kao potencijalno terapijsko sredstvo za kliničko liječenje kolitisa. Međutim, točan mehanizam kojim modulira crijevnu mikrobiotu tek treba potvrditi miševima s nedostatkom mikrobiote i transplantacijom fekalnih bakterija.
Ace, octena kiselina; but, maslačna kiselina; BLG, pandan; DSS, dekstran natrijev sulfat; DAI, indeks aktivnosti bolesti; DPP, dipeptidil peptidaza; FID, detektor ionizacije plamena; F-Con, kontrola; Ekstrakti fekalija miševa; F-DSS, ekstrakti fekalija miševa s DSS kolitisom; F-BLG, ekstrakti fekalija miševa tretiranih BLG-om; GLP-1, peptid sličan glukagonu-1; Gcg, glukagon; plinska kromatografija; GRP43, receptor 43 vezan na G protein; GRP41, receptor 41 vezan na G protein; H&E, hematoksilin-eozin; HBSS, Hanksova uravnotežena otopina soli; OTC, OTC; PCA, analiza glavnih komponenti; PCoA, analiza glavnih koordinata; Pro, propionska kiselina; SASP, sulfasalazin; SCFA, kratkolančane masne kiseline; kineska medicina, tradicionalna kineska medicina; UC, ulcerozni kolitis.
Sve eksperimentalne protokole odobrio je Odbor za etiku životinja Sveučilišta u Pekingu pri Medicinskom centru za znanost i tehnologiju Sveučilišta u Shenzhenu u Hong Kongu (Shenzhen, Kina) u skladu s Institucionalnim smjernicama i Pravilnikom o životinjama (etički broj A2020157).
Svi autori dali su značajan doprinos koncepciji i dizajnu, prikupljanju podataka ili analizi i interpretaciji podataka; sudjelovali su u izradi članka ili kritičkoj reviziji važnog intelektualnog sadržaja; pristali su poslati rukopis u trenutni časopis; konačno odobrili verziju za objavljivanje; odgovorni su za sve aspekte rada.
Ovaj rad podržali su Nacionalna zaklada za prirodne znanosti Kine (81560676 i 81660479), prvoklasni projekt Sveučilišta u Shenzhenu (86000000210), Fond Odbora za inovacije u znanosti i tehnologiji Shenzhena (JCYJ20210324093810026) i Fond za istraživanje medicinske znanosti i tehnologije pokrajine Guangdong (A2020157 i A2020272), Farmaceutski program Medicinskog sveučilišta Guizhou provincije Guizhou financiran od strane Key Laboratory (YWZJ2020-01) i Bolnica Sveučilišta u Pekingu u Shenzhenu (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al. Terapijski potencijal triptolida kao protuupalnog sredstva u eksperimentalnom kolitisu izazvanom dekstran natrijevim sulfatom u miševa. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Globalni teret IBD-a: od 2015. do 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue i dr. Alkaloidi biljnog podrijetla: obećavajući modifikatori bolesti kod upalnih bolesti crijeva. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B i dr. Indigo Naturalis inhibira oksidativni stres debelog crijeva i Th1/Th17 odgovore kod kolitisa induciranog DSS-om u miševa. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Učinkovitost i sigurnost kineskog biljnog lijeka Sophora flavescens (Sophora flavescens) u liječenju ulceroznog kolitisa: klinički dokazi i potencijalni mehanizmi. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Prirodni proizvodi: eksperimentalno učinkoviti lijekovi za liječenje upalnih bolesti crijeva. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913.doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Razmišljanja o adjuvantnom liječenju ulceroznog kolitisa tradicionalnom kineskom medicinom. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT i dr. Učinkovitost i sigurnost Banlangen granula u liječenju sezonske gripe: protokol studije za randomizirano kontrolirano ispitivanje.trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x