Sortiranje proteina u sekretornom putu ključno je za održavanje kompartmentalizacije stanica i homeostaze. Osim sortiranja posredovanog ljuskom, uloga lipida u sortiranju kinezina u procesu sekretornog transporta dugogodišnje je osnovno pitanje na koje još nije odgovoreno. Ovdje provodimo 3D simultano višebojno snimanje visoke rezolucije u stvarnom vremenu kako bismo in vivo dokazali da su novo sintetizirani proteini imobilizirani glikozilfosfatidilinozitolom s vrlo dugim ceramidnim lipidnim dijelovima grupirani i klasificirani u specijalizirana izlazna mjesta endoplazmatske mreže, koja se razlikuju od one koju koriste transmembranski proteini. Osim toga, pokazujemo da je duljina lanca ceramida u membrani endoplazmatskog retikuluma ključna za ovu selektivnost sortiranja. Naša studija pruža prvi izravni in vivo dokaz za klasifikaciju proteinskih tereta na temelju duljine lipidnog lanca u selektivna izvozna mjesta u sekretornom putu.
U eukariotskim stanicama, proteini sintetizirani u endoplazmatskom retikulumu (ER) zatim se sortiraju tijekom transporta kroz sekretorni put radi dostave do odgovarajućeg staničnog odredišta (1). Osim sortiranja posredovanog omotačem, dugo se nagađalo da određeni lipidi mogu poslužiti i kao selektivne izlazne točke grupiranjem u specifične membranske domene koje specifični proteini (2-5). Međutim, još uvijek nedostaju izravni in vivo dokazi koji bi dokazali ovaj mogući mehanizam temeljen na lipidima. Kako bismo riješili ovaj osnovni problem, proučavali smo na kvascu kako se proteini usidreni glikozilfosfatidilinozitolom (GPI) (GPI-AP) diferencijalno izvoze iz ER-a. GPI-AP su razni proteini stanične površine povezani lipidima (6, 7). GPI-AP je izlučeni protein vezan za vanjske listiće plazma membrane putem glikolipidnog dijela (GPI sidro). Oni prihvaćaju GPI sidra kao konzervativne posttranslacijske modifikacije u lumenu ER-a (8). Nakon vezanja, GPI-AP prolazi kroz Golgijev aparat (5, 9) iz ER-a u plazmatsku membranu. Prisutnost GPI sidra uzrokuje da se GPI-AP transportira odvojeno od transmembranski izlučenih proteina (uključujući druge proteine ​​plazma membrane) duž sekretornog puta (5, 9, 10). U stanicama kvasca, GPI-AP-ovi se odvajaju od drugih izlučenih proteina u endoplazmatskom retikulumu, a zatim pakiraju u jedinstvene vezikule omotane kompleksom proteina omotača II (COPII) (6, 7). Odrednice ovog procesa klasifikacije u procesu izvoza ER-a nisu jasne, ali se nagađa da ovaj mehanizam može zahtijevati lipide, posebno strukturno preoblikovanje lipidnog dijela GPI sidra (5, 8). U kvascu, preoblikovanje GPI lipida počinje odmah nakon što se GPI veže, a u mnogim slučajevima uzrokuje vezanje ceramida na zasićenu masnu kiselinu dugog lanca s 26 ugljika (C26:0) (11, 12). C26 ceramid je glavni ceramid koji do sada proizvode stanice kvasca. Sintetizira se u ER-u, a većina se izvozi u Golgijev aparat putem COPII vezikula (13). Izvoz GPI-AP-a iz ER-a specifično zahtijeva kontinuiranu sintezu ceramida (14, 15), a zauzvrat, pretvorba ceramida u inozitol-fosfat ceramid (IPC) u Golgijevom aparatu ovisi o sintezi GPI sidra (16). Biofizičke studije s umjetnim membranama pokazale su da se ceramidi s vrlo dugim acilnim lancem mogu spojiti u uređene domene s jedinstvenim fizičkim svojstvima (17, 18). Ovi podaci vode do hipoteze da C26 ceramid i GPI-AP s C26 ceramidom koriste svoja fizička svojstva za spajanje u uređene regije ili regije u relativno neurednom lipidnom okruženju ER membrane. Uglavnom se sastoji od kratkih i nezasićenih glicerolipida (C16:1 i C18:1) (19, 20). Ove regije bit će selektivno usmjerene na specifična izlazna mjesta ER-a (ERES), gdje se ceramid i GPI-AP na bazi ceramida mogu kotransportirati do Golgijevog aparata u istoj namjenskoj COPII vezikuli (5).
U ovoj studiji izravno smo testirali ovaj mehanizam temeljen na lipidima korištenjem superrezolucijske konfokalne mikroskopije u stvarnom vremenu (SCLIM), što je vrhunska tehnika mikroskopije koja može istovremeno promatrati fluorescentno obilježene proteine. Trobojne i trodimenzionalne (3D) slike imaju izuzetno visoku rezoluciju i brzinu u živim stanicama (21, 22).
Prvo smo primijenili SCLIM tehnologiju kako bismo dodatno definirali kako se normalni GPI-AP s C26 ceramidnom skupinom razlikuje od transmembranski izlučenih proteina nakon napuštanja ER-a u S. cerevisiae. Kako bismo provjerili klasifikaciju ER-a, koristili smo genetički sustav koji može izravno vizualizirati novo sintetizirani teret koji ulazi u ERES in vivo (7, 23). Kao teret odabrali smo GPI-AP Gas1 na bazi C26 ceramida označen zelenim fluorescentnim proteinom (GFP) i transmembranski izlučeni protein Mid2 označen blisko infracrvenim fluorescentnim proteinom (iRFP), koji oba ciljaju plazmatsku membranu (24–26). U temperaturno osjetljivom mutantu sec31-1, ova dva tereta se eksprimiraju pod galaktozom-inducibilnim promotorom i konstitutivnim ERES markerom. Na ekstremnoj temperaturi (37°C), budući da mutacija sec31-1 utječe na funkciju Sec31 komponente omotača COPII da inhibira klijanje COPII i izvoz ER-a, novo sintetizirani teret se nakuplja na ER-u (23). Nakon hlađenja na nisku temperaturu (24°C), mutirane stanice sec31-1 oporavile su se iz sekretornog područja, a akumulirani novi sintetički teret počeo se izvoziti iz ER-a. CLIM vizualizacija pokazala je da se većina novo sintetiziranih Gas1-GFP i Mid2-iRFP još uvijek akumulirala u ER-u mutiranih stanica sec31-1 nakon inkubacije na 37°C, a zatim se oslobađala na 24°C tijekom 5 minuta (Slika 1). Budući da je Mid2-iRFP raspoređen po cijeloj ER membrani, a Gas1-GFP je koncentriran i sakupljen u diskontinuiranom području ER membrane, njihova distribucija je potpuno drugačija (Slika 1, A do C i film S1). Osim toga, kao što je prikazano na Slici 1D, Gas1-GFP klaster nema Mid2-iRFP. Ovi rezultati ukazuju na to da su GPI-AP i transmembranski proteini rano odvojeni u različite regije ER membrane. Klaster Gas1-GFP nalazi se uz specifični ERES označen mCherryjevim COPII proteinom omotača Sec13 (Slika 1, E i F, te film S1) (23).
Stanice sec31-1 eksprimiraju galaktozom inducirane sekrecije, ceramid dugog acilnog lanca (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, zelena) i transmembranski protein Mid2-iRFP (TMP, plava), a ovo konstruktivno ERES označavanje Sec13-mCherry (ERES, magenta) inkubirano je na 37°C tijekom 30 minuta, premješteno na 24°C i snimljeno SCLIM-om 5 minuta kasnije. (A do C) prikazuje reprezentativnu spojenu ili pojedinačnu 2D sliku ravnine (A), 2D projekcijsku sliku 10 z-presjeka (B) ili 3D sliku stanične hemisfere tereta i ERES markera (C). Mjerilo 1μm (A i B). Jedinica mjerila je 0,551μm (C). Gas1-GFP je detektiran u diskretnim ER regijama ili klasterima, dok je Mid2-iRFP detektiran i distribuiran po cijeloj ER membrani (C). (D) Grafikon prikazuje relativni intenzitet fluorescencije Gas1-GFP i Mid2-iRFP u Gas1-GFP klasteru duž bijele strelice (lijevo). AU, proizvoljna jedinica. (E i F) predstavljaju 3D sliku koja kombinira oznake robe i ERES. Gas1-GFP klasteri otkriveni su u blizini specifičnog ERES-a. Jedinica mjerila je 0,551 μm. (F) Bijela puna strelica označava Gas1-GFP klaster povezan s ERES-om. Srednji i desni panel prikazuju spojenu uvećanu 3D sliku i rotirani prikaz odabranog Gas1-GFP klastera.
Bliski prostorni odnos između Gas1-GFP klastera i specifičnog ERES-a ukazuje na to da Gas1-GFP može ući u selektivni ERES, što se razlikuje od selektivnosti koju Mid2-iRFP koristi za napuštanje ER-a. Kako bismo se pozabavili ovom mogućnošću, kvantificirali smo omjer ERES-a za samo jednu ili dvije robe (Slika 2, A do C). Otkrili smo da većina ERES-a (70%) sadrži samo jednu vrstu tereta. Donja slika Slike 2C prikazuje dva tipična primjera ERES-a samo s Gas1-GFP (Slika 1) ili samo s Mid2-iRFP (Slika 2). Nasuprot tome, približno 20% ERES-a sadrži dva tereta koja se preklapaju u istom području. Utvrđeno je da neki ERES (10%) sadrže dvije vrste tereta, ali su izolirani u jasno različitim područjima. Stoga ova statistička analiza pokazuje da se nakon izvoza ER-a, GPI-AP Gas1-GFP i transmembranski teret Mid2-iRFP dijele u različite ERES-ove (Slika 2D). Ova učinkovitost sortiranja vrlo je u skladu s prethodnom biokemijskom analizom (6) i morfološkim određivanjem (7). Također možemo promatrati ponašanje karantenskog tereta koji ulazi u ERES (Slika 2E i Film S2). Slika 2E pokazuje da samo mali dio Gas1-GFP (panel 3) ili Mid2-iRFP (panel 4) ulazi u ERES s jedne strane i ograničen je na zasebno područje. Panel 5 Slike 2E pokazuje da se Gas1-GFP i Mid2-iRFP ponekad nalaze u istom ERES-u, ali ulaze s različitih strana i koncentrirani su u odvojenim regijama koje mogu predstavljati različite COPII vezikule. Također smo potvrdili da je uočeno odvajanje i klasifikacija Gas1 na bazi C26 ceramida GPI-AP kao selektivnog ERES-a specifična jer drugi transmembranski sekretni teret, GFP-označeni protein plazma membrane Axl2 (27), pokazuje slično ponašanje kao Mid2-iRFP. (Slika S1 i Film S3). Novo sintetizirani Axl2-GFP distribuira se kroz ER membranu poput Mid2-iRFP (slika S1, A i B) i kolokaliziran je s Mid2-iRFP u većini ERES-a (slika S1, B do D). Paneli 1 i 2 na slici 1. S1C prikazuje dva tipična primjera ERES-a gdje se dva transmembranska tereta preklapaju. U tim slučajevima, oba tereta ulaze u ERES zajedno (slika S1E, ploča 3 i film S3).
Stanice sec31-1 koje eksprimiraju galaktozom inducibilne sekrecije, Gas1-GFP (GPI-AP, zelena) i Mid2-iRFP (TMP, plava) te konstitutivno ERES označavanje Sec13-mCherry (ERES, magenta) smještene su na 37 °C. Nakon inkubacije od 30 minuta na °C, premještene su na 24 °C kako bi se oslobodio blok sekrecije i snimljene su SCLIM-om nakon 20 minuta. (A do C) Reprezentativne 2D projekcijske slike (A; skala, 1 μm) ili 3D slike staničnih hemisfera (B i C; jedinica skale, 0,456 μm) tereta i 10 z-presjeka označenih s ERES. Donja ploča u (B) i ploča u (C) prikazuju obrađene slike kako bi se prikazale samo robe prisutne u ERES-u (magenta) [Gas1-GFP (siva) i Mid2-iRFP (svijetloplava)]. (C) Otvorena strelica: ERES nosi samo jedan komad tereta (1 do 4). Siva strelica: ERES sadrži odvojeni teret (5). Bijela puna strelica: ERES sadrži kolokirani teret. Dolje: Odabrani pojedinačni ERES sadrži samo Gas1-GFP (1) ili Mid2-iRFP (2). Mjerilo, 100 nm. (D) Kvantifikacija fotomikrografije opisane u (C). Prosječni postotak ERES-a koji sadrži samo jedan teret (Gas1-GFP ili Mid2-iRFP), odvojeni teret i preklapajući teret. U tri neovisna eksperimenta, n=432 u 54 ćelije. Traka pogreške = SD. Dvostrani neparni t-test. *** P = 0,0002. (E) 3D slika odabranog ERES-a tereta u karanteni označenog s (C). Gas1-GFP (zeleno) (3) ili Mid2-iRFP (plavo) (4) ulazi u ERES (magenta) s jedne strane i ograničen je na malo područje unutar ERES-a. Ponekad obje vrste tereta ulaze u isti ERES (5) s iste strane i ograničene su na izolirano područje unutar ERES-a. Mjerna traka, 100 nm.
Zatim smo testirali hipotezu da dugi acilni lanac ceramida (C26) prisutan u ER membrani potiče specifično grupiranje i sortiranje Gas1 u selektivne ERES. U tu svrhu koristili smo modificirani soj kvasca GhLag1, u kojem su dvije endogene ceramidne sintaze Lag1 i Lac1 zamijenjene s GhLag1 (homologom Lag1 pamuka), što je rezultiralo sojem kvasca s ceramidnom membranom kraćom od divljeg tipa (Slika 3A) (28). Analiza masenom spektrometrijom (MS) pokazala je da je u sojevima divljeg tipa 95% ukupnog ceramida ceramid vrlo dugog (C26) lanca, dok je u GhLag1 85% ceramida vrlo dugog (C18 i C16) lanca, samo 2% ceramida ceramid vrlo dugog (C26) lanca. Iako su C18 i C16 ceramidi do sada glavni ceramidi otkriveni u membrani GhLag1, MS analiza je također potvrdila da GPI sidro Gas1-GFP eksprimirano u soju GhLag1 sadrži C26 ceramid, koji je usporediv s lipidima divljeg tipa. Kvaliteta je ista (slika 3A) (26). Stoga to znači da je enzim za preoblikovanje ceramida Cwh43 vrlo selektivan za C26 ceramid, kao što je prikazano na slici 26, on preferencijalno uključuje GPI sidro iz male količine C26 ceramida u soju GhLag1. S2 (29). Ipak, stanična membrana GhLag1 u osnovi sadrži samo C18-C16 ceramid, dok Gas1-GFP još uvijek ima C26 ceramid. Ova činjenica čini ovaj soj idealnim alatom za specifično rješavanje problema duljine acilnog lanca membranskog ceramida u ER-u. Hipotetska uloga klase i sortiranja. Zatim smo prvo proučavali sposobnost C26 Gas1-GFP da se akumulira u klasterima u GhLag1 s temperaturno osjetljivim mutantnim alelom sec31-1 putem konvencionalne fluorescentne mikroskopije, gdje samo dugi (C18-C16) lanac postoji u ceramidu ER membrane (slika 3). Primijetili smo da je u sec31-1 većina Gas1-GFP koncentrirana u klasterima, dok Gas1-GFP u sec31-1 GhLag1 s dugom (C18-C16) ceramidnom ER membranom uglavnom nije bio klasteriran i raspoređen u cijeloj ER membrani. Preciznije, budući da je klasteriranje na bazi C26 ceramida usko povezano sa specifičnim ERES-om (slika 1), zatim smo istražili može li ovaj proces uključivati ​​i funkciju mehanizma proteina za izvoz ER-a. GPI-AP koristi poseban COPII sustav za izvoz ER-a, koji je aktivno reguliran Ted1-ovim strukturnim preoblikovanjem glikanskog dijela GPI sidra (30, 31). Rekombinantni GPI-glikan zatim prepoznaje transmembranski kompleks receptora tereta p24, koji zauzvrat selektivno regrutira Lst1, što je specifična izoforma glavne podjedinice za vezanje tereta COPII, Sec24, tvoreći GPI-AP-bogatu COPII vezikulu (31-33). Stoga smo konstruirali dvostruki mutant koji je kombinirao deleciju ovih pojedinačnih proteina (komponenta kompleksa p24 Emp24, enzim za preoblikovanje GPI-glikana Ted1 i specifična podjedinica COPII Lst1) s mutantnim sojem sec31-1 i proučavali ih. Je li moguće formirati Gas1-klaster GFP (Slika 3). Primijetili smo da je u sec31-1emp24Δ i sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP uglavnom neklasteriran i raspoređen po cijeloj ER membrani, kao što je prethodno viđeno u sec31-1 GhLag1, dok je u sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP sličan sec31-1. Ovi rezultati ukazuju na to da se, osim prisutnosti C26 ceramida u ER membrani, grupiranje Gas1-GFP također mora vezati na p24 kompleks i ne zahtijeva specifično regrutiranje Lst1. Zatim smo istražili mogućnost da duljina lanca ceramida u ER membrani može regulirati vezanje Gas1-GFP na p24. Međutim, otkrili smo da prisutnost C18-C16 ceramida u membrani ne utječe na GPI-glikane rekonstruirane p24 kompleksom (slike S3 i S4, A i B) ili na vezanje na GPI-AP i sposobnost izvoza GPI-AP. Regrutirajte COPII podtip Lst1 (slika S4C). Stoga, grupiranje ovisno o C26 ceramidu ne zahtijeva interakcije proteina s različitim mehanizmima izvoza proteina ER, već podržava alternativni mehanizam sortiranja vođen duljinom lipida. Zatim smo analizirali je li duljina acilnog lanca ceramida u ER membrani važna za učinkovitu klasifikaciju Gas1-GFP kao selektivnog ERES-a. Budući da Gas1 u soju GhLag1 s kratkolančanim ceramidom napušta ER i ulazi u plazmatsku membranu (slika S5), vjerujemo da ako je sortiranje potaknuto duljinom acilnog lanca ceramida, Gas1 u soju GhLag1 može se preusmjeriti i križati. ERES roba s istom membranom.
(A) Stanična membrana GhLag1 uglavnom sadrži kraće C18-C16 ceramide, dok GPI sidro Gas1-GFP i dalje ima isti C26 IPC kao i stanice divljeg tipa. Gore: Analiza duljine acilnog lanca ceramida u staničnoj membrani sojeva divljeg tipa (Wt) i GhLag1p pomoću masene spektrometrije (MS). Podaci predstavljaju postotak ukupnog ceramida. Prosjek tri neovisna eksperimenta. Traka pogreške = SD. Dvostrani neparni t-test. **** P <0,0001. Donja ploča: MS analiza duljine acilnog lanca IPC-a prisutnog u GPI sidru Gas1-GFP (GPI-IPC) eksprimiranom u sojevima divljeg tipa i GhLag1p. Podaci predstavljaju postotak ukupnog IPC signala. Prosjek pet neovisnih eksperimenata. Traka pogreške = SD. Dvostrani neparni t-test. ns, nije važno. P = 0,9134. (B) Fluorescentne mikrografije stanica sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ i sec31-1lst1Δ koje eksprimiraju galaktozom inducirani Gas1-GFP inkubirane su na 37°C tijekom 30 minuta i proslijeđene na rutinsku fluorescentnu mikroskopiju nakon 24°C. Bijela strelica: ER Gas1-GFP klaster. Otvorena strelica: Neklasterirani Gas1-GFP je raspoređen po cijeloj ER membrani, pokazujući karakteristično bojenje nuklearnog prstena za ER. Mjerilo, 5μm. (C) Kvantifikacija fotomikrografije opisane u (B). Prosječni postotak stanica s točkastom Gas1-GFP strukturom. U tri neovisna eksperimenta, n≥300 stanica. Traka pogreške = SD. Dvostrani neparni t-test. **** P <0,0001.
Kako bismo izravno riješili ovaj problem, proveli smo SCLIM vizualizaciju Gas1-GFP i Mid2-iRFP u GhLag1 s temperaturno osjetljivim mutantnim alelom sec31-1 (Slika 4 i Film S4). Nakon što je ER zadržan na 37°C, a potom oslobođen na 24°C, većina novo sintetiziranog Gas1-GFP nije bila grupirana i distribuirana po cijeloj ER membrani, kao što je uočeno konvencionalnim mikroskopima (Slika 4, A i B). Osim toga, veliki postotak ERES-a (67%) uključuje dvije vrste tereta koje se nalaze u njemu (Slika 4D). Paneli 1 i 2 na slici 4C prikazuju dva tipična primjera ERES-a s preklapajućim Gas1-GFP i Mid2-GFP. Osim toga, oba tereta su regrutirana u isti ERES (Slika 4E, panel 3 i film S4). Stoga naši rezultati pokazuju da je duljina ceramidnog acilnog lanca u ER membrani važna odrednica agregacije i klasifikacije ER proteina.
Stanice Sec31-1 GhLag1 koje eksprimiraju galaktozom inducirane sekrete, Gas1-GFP (GPI-AP, zelena) i Mid2-iRFP (TMP, plava) te konstitutivni ERES-označeni Sec13-mCherry (ERES, magenta) Inkubirajte na 37°C. Nastavite 30 minuta, spustite temperaturu na 24°C kako biste oslobodili sekrete i snimite SCLIM-om nakon 20 minuta. (A do C) Reprezentativne 2D projekcijske slike (A; skala, 1μm) ili 3D slike staničnih hemisfera (B i C; jedinica skale, 0,45μm) 10 z-sekcija označenih teretom i ERES-om. Donja ploča u (B) i ploča u (C) prikazuju obrađene slike kako bi se prikazale samo robe prisutne u ERES-u (magenta) [Gas1-GFP (siva) i Mid2-iRFP (svijetloplava)]. (C) Bijela ispunjena strelica: ERES, roba se preklapa. Otvorena strelica: ERES sadrži samo jednu stavku. Donja ploča: Odabrani ERES ima preklapajuće robe (1 i 2) označene u (C). Mjerilo, 100 nm. (D) Kvantifikacija fotomikrografije opisane u (C). U jedinicama sec31-1 i sec31-1 GhLag1 uključen je samo jedan teret (Gas1-GFP ili Mid2-iRFP) i prosječni postotak ERES-a za izolirani teret i preklapajući teret. U tri neovisna eksperimenta, n = 432 u 54 ćelije (sec31-1) i n = 430 u 47 ćelija (sec31-1 GhLag1). Traka pogreške = SD. Dvostrani neparni t-test. *** P = 0,0002 (sec31-1) i ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D slika odabranog ERES-a s preklapajućim teretom (3) označenim u (C). Gas1-GFP (zeleno) i Mid2-iRFP (plavo) prilaze ERES-u (magenta) s iste strane i ostaju u istom ograničenom području ERES-a. Mjerilo, 100 nm.
Ova studija pruža izravne in vivo dokaze da se proteinski tereti na bazi lipida klasificiraju u selektivna mjesta izvoza u sekretornom putu i otkriva važnost duljine acilnog lanca za selektivnost klasifikacije. Koristeći snažnu i najsuvremeniju mikroskopsku tehniku ​​nazvanu SCLIM, demonstrirali smo novo sintetizirani Gas1-GFP (glavni GPI-AP plazma membrane s vrlo dugim acilnim lancem (C26) ceramidnim lipidnim dijelom) u kvascu. Regije grupirane u diskretnim ER-ima povezane su sa specifičnim ERES-om, dok su transmembranski izlučeni proteini raspoređeni po cijeloj ER membrani (Slika 1). Osim toga, ove dvije vrste roba selektivno ulaze u različite ERES-ove (Slika 2). Duljina acilnog lanca staničnog ceramida u membrani smanjuje se s C26 na C18-C16, Gas1-GFP klaster se prekinut je u diskretnu ER regiju, a Gas1-GFP se preusmjerava kako bi napustio ER s transmembranskim proteinom kroz isti ERES (Slika 3 i Slika 3). 4).
Iako GPI-AP koristi specijalizirani proteinski mehanizam za izlazak iz ER-a, otkrili smo da se separacija ovisna o ceramidu C26 ne oslanja na diferencijalne interakcije proteina koje mogu dovesti do specijalizacije ERES-a (slike S4 i S5). Umjesto toga, naši nalazi podržavaju alternativni klasifikacijski mehanizam potaknut grupiranjem proteina na bazi lipida i naknadnim isključivanjem drugih tereta. Naša zapažanja pokazuju da Gas1-GFP regiji ili klasteru povezanom sa specifičnim ERES-om nedostaje transmembranski izlučeni protein Mid2-iRFP, što ukazuje na to da će C26 ceramid-ovisni GPI-AP klaster olakšati njihov ulazak u relevantni ERES, a istovremeno isključiti transmembranski ulazak sekreta u ovaj određeni ERES (slike 1 i 2). Nasuprot tome, prisutnost C18-C16 ceramida u ER membrani ne uzrokuje stvaranje regija ili klastera GPI-AP-a, tako da oni ne isključuju niti zamjenjuju transmembranski izlučene proteine ​​u istom ERES-u (slike 3 i 4). Stoga pretpostavljamo da C26 ceramid potiče separaciju i klasifikaciju olakšavajući grupiranje proteina povezanih sa specifičnim ERES-om.
Kako postići ovo grupiranje ovisno o C26 ceramidu u specifično područje ER-a? Tendencija membranskog ceramida da se lateralno odvaja može uzrokovati da GPI-AP i C26 ceramid formiraju male i trenutno uređene lipide u nepravilnijem lipidnom okruženju ER membrane koji sadrži kraće i nezasićene glicerolipide. Kvalitetni klasteri (17, 18). Ovi mali privremeni klasteri mogu se dalje spajati u veće, stabilnije klastere nakon vezanja na p24 kompleks (34). U skladu s tim, pokazali smo da C26 Gas1-GFP treba interagirati s p24 kompleksom kako bi formirao veće vidljive klastere (Slika 3). P24 kompleks je heterozigotni oligomer sastavljen od četiri različita transmembranska proteina p24 u kvascu (35), koji omogućuje multivalentno vezanje, što može dovesti do umrežavanja malih GPI-AP klastera, čime se stvara veći stabilni klaster (34). Interakcija između proteinskih ektodomena GPI-AP-ova također može doprinijeti njihovoj agregaciji, kao što je prikazano tijekom njihovog Golgijevog transporta u polariziranim epitelnim stanicama sisavaca (36). Međutim, kada je C18-C16 ceramid prisutan u ER membrani, kada se p24 kompleks veže na Gas1-GFP, neće se formirati veliki odvojeni klasteri. Temeljni mehanizam može ovisiti o specifičnim fizikalnim i kemijskim svojstvima ceramida dugog acilnog lanca. Biofizičke studije umjetnih membrana pokazuju da iako i ceramidi dugog (C24) i kratkog (C18-C16) acilnog lanca mogu uzrokovati odvajanje faza, samo ceramidi dugog acilnog lanca (C24) mogu potaknuti visoku zakrivljenost i savijanje filma kako bi preoblikovali film. Međusobnim upućivanjem (17, 37, 38) pokazalo se da transmembranska spirala TMED2, ljudskog homologa Emp24, selektivno interagira sa sfingomijelinom na bazi C18 ceramida u citoplazmatskim lobulima (39). Korištenjem simulacija molekularne dinamike (MD) otkrili smo da se i C18 i C26 ceramidi akumuliraju oko citoplazmatskih režnjeva transmembranske spirale Emp24 i imaju slične preferencije (slika S6). Vrijedi napomenuti da to ukazuje na to da transmembranska spirala Emp24 može dovesti do asimetrične raspodjele lipida u membrani. Ovo je nedavni rezultat temeljen na stanicama sisavaca. Slične MD simulacije također pokazuju prisutnost eterskih lipida (40). Stoga nagađamo da je C26 ceramid u dva režnjeva ER26 lokalno obogaćen. Kada se GPI-AP u luminalnim režnjevima izravno veže za multivalentni p24 i akumulacija C26 ceramida oko p24 u citoplazmatskim režnjevima, to može potaknuti popratnu agregaciju proteina i zakrivljenost membrane koja se stvara kroz prste (41), uzrokujući odvajanje GPI-AP-a u diskretne regije uz ERES, što također pogoduje jako zakrivljenim regijama ER membrane (42). Prethodna izvješća podržala su predloženi mehanizam (43, 44). Multivalentno vezanje oligolektina, patogena ili antitijela na glikosfingolipide na bazi ceramida (GSL) na plazmatskoj membrani pokreće veliku agregaciju GSL-a, pojačava razdvajanje faza i uzrokuje deformaciju i internalizaciju membrane (44). Iwabuchi itd. (43) Utvrđeno je da u prisutnosti dugih (C24), ali ne i kratkih (C16) acilnih lanaca, multivalentni ligand vezan na GSL laktozilceramid inducira stvaranje velikih nakupina i invaginaciju membrane, a citoplazma Lyn-posredovana transdukcija signala na listićima isprepletena je acilnim lancima u spojenim neutrofilima.
U polariziranim epitelnim stanicama sisavaca, koncentracija anti-Golgijeve mreže (TGN) do razine apikalne plazma membrane kontrolira odvajanje i sortiranje GPI-AP-a (10, 45). Ova agregacija je potaknuta oligomerizacijom GPI-AP-a (36), ali može ovisiti i o duljini ceramidnog lanca koju nalazimo u kvascu. Iako sisavčev GPI-AP ima sidro na bazi eterskih lipida, a njegova kemijska struktura se vrlo razlikuje od ceramida vrlo dugog acilnog lanca, nedavna studija je otkrila da oba lipida imaju evolucijski slična fizikalna i kemijska svojstva i funkciju (40). Stoga, dio eterskih lipida u stanicama sisavaca može biti sličan ceramidu C26 u kvascu, a njegova je uloga povezati se s ceramidom dugog lanca u membrani kako bi se potaknula agregacija i sortiranje GPI-AP-a. Iako ovu mogućnost još treba izravno testirati, prethodni nalazi podupiru da se transport ceramida dugog acilnog lanca u Golgijevo tijelo ne provodi citoplazmatskim prijenosnim proteinima, već ovisi o sintezi GPI sidara poput kvasca. Stoga se čini da evolucijski konzervativni mehanizam može selektivno kotransportirati ceramid vrlo dugog acilnog lanca i GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) u istoj transportnoj vezikuli.
U sustavima polariziranih epitelnih stanica kvasca i sisavaca, agregacija i odvajanje GPI-AP-a od ostalih proteina plazma membrane događaju se prije dosezanja površine stanice. Paladino i sur. (48) otkrili su da na TGN-u polariziranih epitelnih stanica sisavaca, grupiranje GPI-AP-a nije samo potrebno za selektivnu klasifikaciju GPI-AP-a na apikalnu plazma membranu, već i regulira organizaciju grupiranja GPI-AP-a i njegovu biološku aktivnost. Površina stanice. Kod kvasca, ova studija je pokazala da C26 ceramid-ovisni GPI-AP klaster na ER-u može regulirati organizaciju klastera i funkcionalnu aktivnost GPI-AP-a na plazma membrani (24, 49). U skladu s ovim modelom, GhLag1 stanice su alergične na GPI inhibitore ili lijekove koji utječu na integritet stanične stijenke (28), a potreba za funkcionalnim Gas1-GFP klasterima (49) vršnog ceramida projiciranog u parenju stanica kvasca ukazuje na G. Moguće fiziološke posljedice hLag1 stanica. Pogreška GPI-AP-a. Međutim, daljnje testiranje je li funkcionalna organizacija stanične površine programirana iz ER-a metodom sortiranja na temelju duljine lipida bit će predmet naših budućih istraživanja.
Sojevi Saccharomyces cerevisiae korišteni u ovom radu navedeni su u Tablici S1. Sojevi MMY1583 i MMY1635 SCLIM-a za snimanje živih stanica konstruirani su u pozadini W303. Ovi sojevi koji eksprimiraju Sec13-mCherry s fluorescentnom proteinskom oznakom konstruirani su korištenjem metode temeljene na lančanoj reakciji polimeraze (PCR) s plazmidom pFA6a kao predloškom (23). Soj koji eksprimira Mid2-iRFP označen fluorescentnim proteinom pod kontrolom GAL1 promotora konstruiran je na sljedeći način. PCR amplifikacija iRFP-KanMx sekvence iz pKTiRFP-KAN vektora (dar E. O'Shea, Addgene plazmid broj 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identifikator istraživačkog resursa (RRID): Addgene_64687) i umetnuta u C-terminus endogenog Mid2. Nakon što je sekvenca genoma Mid2-iRFP amplificirana i klonirana u GAL1 promotor, integrirana je u Not I-Sac I mjesto integracije plazmida pRS306. Rezultirajući plazmid pRGS7 lineariziran je s Pst I kako bi se integrirao u lokus URA3.
Fuzijski gen Gas1-GFP eksprimira se pod kontrolom GAL1 promotora u centromernom (CEN) plazmidu, koji je konstruiran na sljedeći način. Sekvenca Gas1-GFP je amplificirana PCR-om iz plazmida pRS416-GAS1-GFP (24) (dar L. Popolo) i klonirana u mjesto Xma I–Xho I CEN plazmida pBEVY-GL LEU2 (dar C). Miller; Addgene plazmid broj 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Rezultirajući plazmid nazvan je pRGS6. Fuzijski gen Axl2-GFP također se eksprimira pod kontrolom GAL1 promotora vektora pBEVY-GL LEU2, a njegova konstrukcija je sljedeća. Sekvenca Axl2-GFP je amplificirana iz plazmida pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) PCR-om i klonirana u Bam HI-Pst I mjesto vektora pBEVY-GL LEU2. Rezultirajući plazmid je nazvan pRGS12. Sekvenca oligonukleotida korištenih u ovoj studiji navedena je u Tablici S2.
Soj je obogaćen s 0,2% adenina i 2% glukoze [YP-dekstroza (YPD)], 2% rafinozom [YP-rafinoza] bogatim medijem proteina p (YP) ekstrakta kvasca (1% ekstrakta kvasca i 2% proteina ept). (YPR)] ili 2% galaktozom [YP-galaktoza (YPG)] kao izvorom ugljika, ili u sintetičkom minimalnom mediju (0,15% dušikove baze kvasca i 0,5% amonijevog sulfata) za nadopunu odgovarajućih aminokiselina i baza potrebnih za prehranu, te koji sadrži 2% glukoze (sintetički minimalni medij glukoze) ili 2% galaktoze (sintetički minimalni medij galaktoze) kao izvor ugljika.
Za snimanje u stvarnom vremenu, temperaturno osjetljive sec31-1 mutantne stanice koje eksprimiraju konstrukt pod GAL1 promotorom uzgajane su u YPR mediju na 24°C preko noći do sredine log faze. Nakon indukcije u YPG na 24°C tijekom 1 sata, stanice su inkubirane u SG na 37°C tijekom 30 minuta, a zatim prenesene na 24°C radi oslobađanja iz bloka sekrecije. Konkanavalin A korišten je za fiksiranje stanica na staklenoj pločici i snimanje SCLIM-om. SCLIM je kombinacija inverznog fluorescentnog mikroskopa Olympus IX-71 i uljne leće UPlanSApo 100×1.4 s numeričkom aperturom (Olympus), brzog konfokalnog skenera s rotirajućim diskom i visokim omjerom signala i šuma (Yokogawa Electric), prilagođenog spektrometra i prilagođenog hlađenja. Pojačivač slike sustava (Hamamatsu Photonics) može osigurati sustav povećala s konačnim povećanjem od ×266,7 i kameru s uređajem s nabojno spregnutim uređajem koja množi elektrone (Hamamatsu Photonics) (21). Snimanje slike vrši se prilagođenim softverom (Yokogawa Electric). Za 3D slike koristili smo prilagođeni piezoelektrični aktuator za vertikalno vibriranje objektiva i prikupili optičke dijelove udaljene 100 nm u snop. Z-složena slika pretvara se u 3D vokselske podatke, a teorijska funkcija širenja točaka korištena za konfokalni mikroskop s rotirajućim diskom koristi se za dekonvolucijsku obradu pomoću softvera Volocity (PerkinElmer). Korištenjem Volocity softvera za automatsko određivanje praga za analizu kolokacije, izmjeren je ERES uključujući teret. Analiza linijskog skeniranja provedena je pomoću MetaMorph softvera (Molecular Devices).
Za određivanje statističke značajnosti upotrijebite GraphPad Prism softver. Za dvostrani Studentov t-test i obični jednosmjerni test analize varijance (ANOVA), razlike između skupina smatraju se značajnim utjecajem na P <0,05 (*).
Za fluorescentnu mikroskopiju Gas1-GFP, stanice log faze su uzgajane preko noći u YPD-u i sakupljene centrifugiranjem, isprane dva puta fosfatno puferiranom otopinom soli i inkubirane na ledu najmanje 15 minuta, a zatim obrađene pod mikroskopom kako je prethodno opisano (24). Za akviziciju je korišten Leica DMi8 mikroskop (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) opremljen objektivom, L5 (GFP) filterom, Hamamatsu kamerom i softverom Application Suite X (LAS X).
Uzorci su denaturirani SDS puferom za uzorke na 65°C tijekom 10 minuta, a zatim odvojeni SDS-poliakrilamidnom elektroforezom (PAGE). Za imunoblot analizu, 10 μl uzorka je naneseno po traku. Primarno antitijelo: Koristite zečje poliklonsko anti-Gas1 u razrjeđenju 1:3000, zečje poliklonsko anti-Emp24 u razrjeđenju 1:500 i zečje poliklonsko anti-GFP (dar od H. Riezmana) u razrjeđenju 1:3000. Mišje monoklonsko anti-Pgk1 antitijelo korišteno je u razrjeđenju 1:5000 (dar od J. de la Cruza). Sekundarno antitijelo: Kozji anti-zečji imunoglobulin G (IgG) konjugiran s hren peroksidazom (HRP) korišten je u razrjeđenju 1:3000 (Pierce). Kozji anti-mišji IgG konjugiran s HRP korišten je u razrjeđenju 1:3000 (Pierce). Zona imunološkog odgovora promatrana je kemiluminiscencijskom metodom SuperSignal West Pico reagensa (Thermo Fisher Scientific).
Kao što je opisano u (31), proveden je eksperiment prirodne imunoprecipitacije na obogaćenoj ER frakciji. Ukratko, stanice kvasca isprati s TNE puferom [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida i smjesa inhibitora proteaze) na 600 nm (OD600) pri optičkoj gustoći od 100 dva puta. Razbijen je staklenim kuglicama, a zatim su stanični ostaci i staklene kuglice uklonjeni centrifugiranjem. Supernatant je zatim centrifugiran na 17 000 g tijekom 15 minuta na 4 °C. Talog je resuspendiran u TNE i dodan je digitalis saponin do konačne koncentracije od 1%. Suspenzija je inkubirana 1 sat uz rotaciju na 4 °C, a zatim su netopljive komponente uklonjene centrifugiranjem na 13 000 g na 4 °C tijekom 60 minuta. Za imunoprecipitaciju Gas1-GFP, prvo prethodno inkubirajte uzorak s praznim agaroznim kuglicama (ChromoTek) na 4°C tijekom 1 sata, a zatim inkubirajte s GFP-Trap_A (ChromoTek) na 4°C tijekom 3 sata. Imunoprecipitirane kuglice su pet puta isprane s TNE koji sadrži 0,2% digoksigenina, eluirane SDS puferom za uzorke, odvojene na SDS-PAGE i analizirane imunoblotingom.
Kao što je opisano u (31), određivanje umrežavanja provedeno je na obogaćenoj ER frakciji. Ukratko, obogaćena ER frakcija inkubirana je s 0,5 mM ditiobis(sukcinimidil propionatom) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, SAD; 20°C, 20 min). Reakcija umrežavanja prekinuta je dodavanjem glicina (konačna koncentracija 50 mM, 5 minuta, 20°C).
Kao što je prethodno opisano (50), provedena je MS analiza ceramida u sojevima divljeg tipa i GhLag1. Ukratko, stanice su uzgajane do eksponencijalne faze (3 do 4 OD600 jedinice/ml) u YPD na 30°C, a sakupljeno je 25×107 stanica. Njihov metabolizam je ugašen trikloroctenom kiselinom. Koristite otapalo za ekstrakciju [etanol, voda, eter, piridin i 4,2 N amonijev hidroksid (15:15:5:1:0,018 v/v)] i 1,2 nmol internog standarda C17 ceramida (860517, Avanti polarni lipid) kvalitete). Koristite monometilaminski reagens [metanol, voda, n-butanol i otopina metilamina (4:3:1:5 v/v)] za provođenje blage alkalne hidrolize ekstrakta, a zatim koristite vodom zasićeni n-butanol za odsoljavanje. Konačno, ekstrakt je resuspendiran u otapalu pozitivnog moda [kloroform/metanol/voda (2:7:1) + 5 mM amonijev acetat] i ubrizgan u maseni spektrometar. Višestruko reakcijsko praćenje (MRM) provedeno je za identifikaciju i kvantifikaciju molekula sfingolipida. Tercijarni kvadrupolni maseni spektrometar TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) opremljen je robotskim nanoflow izvorom iona Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) za analizu lipida. Energija sudara je optimizirana za svaku kategoriju ceramida. MS podaci dobiveni su u pozitivnom modu. Za svaki biološki replikat, lipidni signal je medijan triju neovisnih mjerenja.
Kao što je opisano u (31), stanice (800×107) koje eksprimiraju Gas1-GFP podvrgnute su prirodnoj imunoprecipitaciji. Pročišćeni Gas1-GFP odvojen je SDS-PAGE i prenesen na poliviniliden fluoridnu (PVDF) membranu. Protein je vizualiziran bojenjem PVDF-a amidnom crnom bojom. Gas1-GFP traka je izrezana s PVDF-a i isprana 5 puta metanolom i jednom vodom tekućinske kromatografije-MS (LC-MS) kvalitete. Inkubacijom membranske trake s 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), puferom i 500 μl svježe otopljene 1 M smjese natrijevog nitrita na 37°C tijekom 3 sata, lipidna frakcija se oslobađa iz Gas1-GFP i lizira se oslobađanje inozin fosfat ceramida između glukozamina i inozitola (51). Nakon toga, membranska traka je isprana četiri puta vodom LC-MS kvalitete, osušena na sobnoj temperaturi i pohranjena u atmosferi dušika na -80°C do analize. Kao kontrola, za svaki eksperiment korišten je slijepi uzorak PVDF membrane. Lipid ekstrahiran iz Gas1-GFP zatim je analiziran MS-om kako je opisano (50). Ukratko, PVDF trake koje sadrže GPI-lipid resuspendirane su u 75 μl negativnog otapala za kalup [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonijev acetat] i podvrgnute analizi sfingolipidnih vrsta elektrosprejnom ionizacijom (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). U ovom slučaju, MS podaci dobiveni su u modu negativnih iona.
Kao što je ranije spomenuto, lipidni dio GPI sidra odvojen je od [3H]-inozitolom obilježenog GPI-AP-a (16). Lipidi su odvojeni tankoslojnom kromatografijom korištenjem sustava otapala (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) i vizualizirani korištenjem FLA-7000 (Fujifilm).
Stanice koje eksprimiraju Gas1-GFP (600×107) isprane su dva puta s TNE puferom i razbijene staklenim kuglicama, a zatim centrifugirane kako bi se uklonili stanični ostaci i staklene kuglice. Supernatant je zatim centrifugiran na 17 000 g tijekom 1 sata na 4 °C. Talog je ispran u TNE i inkubiran s 1 U PI-PLC (Invitrogen) u TNE koji sadrži 0,2% digitalis saponina tijekom 1 sata na 37 °C. Nakon tretmana enzimima, membrana je uklonjena centrifugiranjem na 17 000 g na 4 °C tijekom 1 sata. Za imunoprecipitaciju Gas1-GFP, supernatant je inkubiran s GFP-Trap_A (ChromoTek) na 4 °C preko noći. Pročišćeni Gas1-GFP odvojen SDS-PAGE obojen je Coomassie briljantno plavom bojom. Gas1-GFP traka za bojenje odsječena je od sive boje koja okružuje akvadukt, a zatim je nakon alkilacije jodoacetamidom i redukcije ditiotreitolom provedena digestija u gelu s tripsinom. Triptični peptidi i peptidi s GPI-glikanima ekstrahirani su i osušeni. Osušeni peptid otopljen je u 20 μl vode. Dio (8 μl) ubrizgan je u LC. Za odvajanje peptida pod specifičnim gradijentnim uvjetima korištena je oktadecilsilanska (ODS) kolona (Develosil 300ODS-HG-5; unutarnji promjer 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, prefektura Aichi, Japan). Mobilna faza je otapalo A (0,08% mravlja kiselina) i otapalo B (0,15% mravlja kiselina u 80% acetonitrilu). Za eluiranje kolone otapalom A unutar 55 minuta pri brzini protoka od 50 μl min-1 tijekom 5 minuta korišten je Accela HPLC sustav (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts), a zatim je koncentracija otapala B povećana na 40%. Eluat je kontinuirano uvođen u ESI izvor iona, a triptični peptidi i peptidi s GPI-glikanima analizirani su pomoću LTQ Orbitrap XL (hibridni linearni ionski trap-orbitrap maseni spektrometar; Thermo Fisher Scientific). U MS postavci, napon kapilarnog izvora postavljen je na 4,5 kV, a temperatura prijenosne kapilare održavana je na 300 °C. Napon kapilare i napon leće cijevi postavljeni su na 15 V odnosno 50 V. MS podaci dobiveni su u modu pozitivnih iona (rezolucija od 60 000; točnost mase od 10 dijelova na milijun) u rasponu mase od 300/m/z omjera mase/naboja (m/z) 3000. MS/MS podaci dobiveni su putem ionske zamke u LTQ Orbitrap XL [prve 3 znamenke o kojima ovise podaci, disocijacija inducirana sudarom (CID)].
MD simulacije su provedene korištenjem GROMACS (52) softvera i MARTINI 2 polja sile (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) je zatim korišten za konstrukciju dvosloja koji sadrži dioleoilfosfatidilkolin (DOPC) i Cer C18 ili DOPC i Cer C26. Topologija i koordinate Cer C26 izvedene su iz DXCE uklanjanjem dodatnih kuglica iz sfingozinskog repa. Koristite dolje opisani postupak za uravnoteženje dvostrukog sloja i njegovo pokretanje, a zatim koristite posljednje koordinate sustava za izgradnju sustava koji sadrži Emp24. Transmembranska domena kvasca Emp24 (ostaci 173 do 193) konstruirana je kao α-heliks korištenjem vizualnog MD (VMD) alata za molekularnu strukturu (58). Zatim, nakon uklanjanja preklapajućih lipida, protein je grubo granuliran i umetnut u dvosloj korištenjem CHARMM GUI-ja. Konačni sustav sadrži 1202 DOPC i 302 Cer C26 ili 1197 DOPC i 295 Cer C18 i Emp24. Sustav se ionizira do koncentracije od 0,150 M. Napravljene su četiri neovisne replike za dva dvoslojna sastava.
Lipidni dvosloj se balansira pomoću CHARMM GUI procesa, koji uključuje minimiziranje, a zatim balansiranje 405 000 koraka, gdje se ograničenja položaja postupno smanjuju i eliminiraju, a vremenski korak se povećava s 0,005 ps na 0,02 ps. Nakon uravnoteženja, proizvodi 6 µs s vremenskim korakom od 0,02 ps. Nakon umetanja Emp24, upotrijebite isti CHARMM GUI proces za minimiziranje i balansiranje sustava, a zatim ga pokrenite 8 s u produkciji.
Za sve sustave, tijekom procesa balansiranja, tlak se kontrolira Berendsenovim barostatom (59), a tijekom proizvodnog procesa tlak se kontrolira Parrinello-Rahmanovim barostatom (60). U svim slučajevima, prosječni tlak je 1 bar i koristi se poluizotropna shema spajanja tlaka. U procesu ravnoteže i proizvodnje, termostat (61) s ponovnom kalibracijom brzine koristi se za spajanje temperature proteinskih, lipidnih i čestica otapala. Tijekom cijelog rada, ciljana temperatura je 310 K. Interakcija bez vezanja izračunava se generiranjem liste sparivanja pomoću Verletove sheme s tolerancijom pufera od 0,005. Coulombov član izračunava se pomoću reakcijskog polja i granične udaljenosti od 1,1 nm. Vander Waalsov član koristi graničnu shemu s graničnom udaljenosti od 1,1 nm, a Verletova granična shema koristi se za potencijalni drift (62).
Korištenjem VMD-a, granična valna duljina između DOPC fosfatnih kuglica ili ceramidnih AM1 kuglica i proteina je 0,7 nm, a izračunava se broj lipida koji stupaju u interakciju s proteinom. Prema sljedećoj formuli, izračunajte faktor osiromašenja-obogaćivanja (DE) kao u (63): DE faktor = (količina ukupnih lipida u proteinu 0,7) u proteinu 0,7 (količina Cer u ukupnim lipidima)
Prikazana vrijednost dobiva se kao prosjek, a stupci pogreške su četiri neovisne kopije SE. Statistička značajnost DE faktora izračunava se t-testom [(prosječnaDE-faktor-1)/SE]. Izračunajte P-vrijednost iz jednostrane distribucije.
Alat GROMACS korišten je za izračun 2D lateralne karte gustoće sustava koji sadrži Emp24 unutar posljednjih 250 ns traga. Kako bi se dobila karta obogaćenja/osiromašenja ceramida, karta gustoće Cera podijeljena je zbrojem karte Cera i DOPC-a, a zatim podijeljena koncentracijom Cera u tijelu. Koristi se ista skala karte boja.
Za dodatne materijale za ovaj članak, pogledajte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod uvjetima Creative Commons licence Imenovanje-Nekomercijalno, koja dopušta korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, sve dok konačna upotreba nije u komercijalne svrhe i pretpostavka je da je izvorno djelo ispravno. Referenca.
Napomena: Molimo vas da navedete svoju adresu e-pošte samo kako bi osoba koju preporučite stranici znala da želite da vidi e-poštu i da se ne radi o neželjenoj pošti. Nećemo prikupljati nikakve adrese e-pošte.
Ovo pitanje se koristi za provjeru jeste li posjetitelj i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D snimanje visoke rezolucije u stvarnom vremenu otkriva važnost duljine ceramidnog lanca za sortiranje proteina na selektivnim izlaznim mjestima.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D snimanje visoke rezolucije u stvarnom vremenu otkriva važnost duljine ceramidnog lanca za sortiranje proteina na selektivnim izlaznim mjestima.
©2020 Američka udruga za napredak znanosti. sva prava pridržana. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.