Hvala vam što ste posjetili nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo korištenje najnovije verzije preglednika (ili isključivanje načina kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, ova stranica neće uključivati ​​stilove ili JavaScript.
Vodikov sulfid (H2S) ima višestruke fiziološke i patološke učinke na ljudski organizam. Natrijev hidrosulfid (NaHS) se široko koristi kao farmakološko sredstvo za procjenu učinaka H2S u biološkim eksperimentima. Iako gubitak H2S iz otopina NaHS traje samo nekoliko minuta, otopine NaHS korištene su kao donorski spojevi za H2S u vodi za piće u nekim studijama na životinjama. Ova studija istraživala je može li voda za piće s koncentracijom NaHS od 30 μM pripremljena u bocama za štakore/miševe ostati stabilna najmanje 12-24 sata, kako sugeriraju neki autori. Pripremite otopinu NaHS (30 μM) u vodi za piće i odmah je ulijte u boce za vodu za štakore/miševe. Uzorci su prikupljeni s vrha i unutrašnjosti boce za vodu nakon 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 i 24 sata kako bi se izmjerio sadržaj sulfida metodom metilenskog plavog. Osim toga, mužjacima i ženkama štakora ubrizgavan je NaHS (30 μM) tijekom dva tjedna, a koncentracije sulfida u serumu mjerene su svaki drugi dan tijekom prvog tjedna i na kraju drugog tjedna. Otopina NaHS u uzorku dobivenom s vrha boce s vodom bila je nestabilna; smanjila se za 72% i 75% nakon 12 odnosno 24 sata. U uzorcima dobivenim iz unutrašnjosti boca s vodom, smanjenje NaHS nije bilo značajno unutar 2 sata; međutim, smanjilo se za 47% i 72% nakon 12 odnosno 24 sata. Injekcija NaHS nije utjecala na razinu sulfida u serumu mužjaka i ženki štakora. Zaključno, otopine NaHS pripremljene od vode za piće ne smiju se koristiti za doniranje H2S jer je otopina nestabilna. Ovaj put primjene izložit će životinje neredovitim i manjim količinama NaHS od očekivanih.
Vodikov sulfid (H2S) se koristi kao toksin od 1700. godine; međutim, njegovu moguću ulogu kao endogene biosignalne molekule opisali su Abe i Kimura 1996. godine. Tijekom posljednja tri desetljeća razjašnjene su brojne funkcije H2S u raznim ljudskim sustavima, što je dovelo do spoznaje da molekule donori H2S mogu imati kliničku primjenu u liječenju ili upravljanju određenim bolestima; vidi Chirino i sur. za nedavni pregled.
Natrijev hidrosulfid (NaHS) se široko koristi kao farmakološko sredstvo za procjenu učinaka H2S u mnogim studijama na staničnim kulturama i životinjama5,6,7,8. Međutim, NaHS nije idealan donor H2S jer se u otopini brzo pretvara u H2S/HS-, lako se kontaminira polisulfidima te lako oksidira i isparava4,9. U mnogim biološkim eksperimentima, NaHS se otapa u vodi, što rezultira pasivnim isparavanjem i gubitkom H2S10,11,12, spontanom oksidacijom H2S11,12,13 i fotolizom14. Sulfid u izvornoj otopini se vrlo brzo gubi zbog isparavanja H2S11. U otvorenoj posudi, vrijeme poluraspada (t1/2) H2S je oko 5 minuta, a njegova koncentracija se smanjuje za oko 13% u minuti10. Iako gubitak sumporovodika iz otopina NaHS traje samo nekoliko minuta, neke studije na životinjama koristile su otopine NaHS kao izvor sumporovodika u vodi za piće tijekom 1-21 tjedna, zamjenjujući otopinu koja sadrži NaHS svakih 12-24 sata.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Ova praksa nije u skladu s načelima znanstvenog istraživanja, budući da bi doze lijekova trebale biti temeljene na njihovoj upotrebi kod drugih vrsta, posebno ljudi.27
Predklinička istraživanja u biomedicini imaju za cilj poboljšati kvalitetu skrbi za pacijente ili ishode liječenja. Međutim, rezultati većine studija na životinjama još nisu primijenjeni na ljude28,29,30. Jedan od razloga ovog neuspjeha u prevođenju je nedostatak pažnje posvećene metodološkoj kvaliteti studija na životinjama30. Stoga je cilj ove studije bio istražiti mogu li otopine NaHS od 30 μM pripremljene u bocama za vodu za štakore/miševe ostati stabilne u vodi za piće 12-24 sata, kako se tvrdi ili sugerira u nekim studijama.
Svi eksperimenti u ovoj studiji provedeni su u skladu s objavljenim smjernicama za njegu i korištenje laboratorijskih životinja u Iranu31. Sva eksperimentalna izvješća u ovoj studiji također su slijedila smjernice ARRIVE32. Etički odbor Instituta za endokrine znanosti Sveučilišta medicinskih znanosti Shahid Beheshti odobrio je sve eksperimentalne postupke u ovoj studiji.
Cinkov acetat dihidrat (CAS: 5970-45-6) i bezvodni željezov klorid (CAS: 7705-08-0) kupljeni su od Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Francuska). Natrijev hidrosulfid hidrat (CAS: 207683-19-0) i N,N-dimetil-p-fenilendiamin (DMPD) (CAS: 535-47-0) kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Izofluran je kupljen od Piramal (Bethlehem, PA, SAD). Klorovodična kiselina (HCl) kupljena je od Merck (Darmstadt, Njemačka).
Pripremite otopinu NaHS (30 μM) u vodi za piće i odmah je ulijte u boce za vodu za štakore/miševe. Ova koncentracija je odabrana na temelju brojnih publikacija koje koriste NaHS kao izvor H2S; vidi odjeljak Rasprava. NaHS je hidratizirana molekula koja može sadržavati različite količine hidratacijske vode (tj. NaHS•xH2O); prema proizvođaču, postotak NaHS korištenog u našoj studiji bio je 70,7% (tj. NaHS•1,3 H2O), a tu smo vrijednost uzeli u obzir u našim izračunima, gdje smo koristili molekularnu težinu od 56,06 g/mol, što je molekularna težina bezvodnog NaHS. Hidratacijska voda (također nazvana kristalizacijska voda) su molekule vode koje čine kristalnu strukturu33. Hidrati imaju različita fizikalna i termodinamička svojstva u usporedbi s anhidratima34.
Prije dodavanja NaHS u vodu za piće, izmjerite pH i temperaturu otapala. Odmah ulijte otopinu NaHS u bocu za vodu za štakore/miševe u kavezu za životinje. Uzorci su prikupljeni s vrha i iz unutrašnjosti boce za vodu u 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 i 24 sata kako bi se izmjerio sadržaj sulfida. Mjerenja sulfida provedena su odmah nakon svakog uzorkovanja. Uzorke smo dobili s vrha epruvete jer su neke studije pokazale da mala veličina pora cijevi za vodu može smanjiti isparavanje H2S15,19. Čini se da se ovaj problem odnosi i na otopinu u boci. Međutim, to nije bio slučaj s otopinom u grlu boce za vodu, koja je imala veću brzinu isparavanja i autooksidirala je; zapravo, životinje su prvo popile ovu vodu.
U studiji su korišteni mužjaci i ženke Wistar štakora. Štakori su bili smješteni u polipropilenskim kavezima (2-3 štakora po kavezu) pod standardnim uvjetima (temperatura 21-26 °C, vlažnost 32-40%) s 12 sati svjetla (od 7 do 19 sati) i 12 sati mraka (od 19 do 7 sati). Štakori su imali slobodan pristup vodi iz slavine i hranjeni su standardnom hranom (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Ženke (n=10, tjelesna težina: 190-230 g) i mužjaci (n=10, tjelesna težina: 320-370 g) Wistar štakora odgovarajuće dobi (6 mjeseci) nasumično su podijeljeni u kontrolnu skupinu i skupinu tretiranu NaHS-om (30 μM) (n=5 po skupini). Za određivanje veličine uzorka koristili smo KISS (Keep It Simple, Stupid) pristup, koji kombinira prethodna iskustva i analizu snage35. Prvo smo proveli pilot studiju na 3 štakora i odredili srednju razinu ukupnog sulfida u serumu i standardnu ​​devijaciju (8,1 ± 0,81 μM). Zatim, uzimajući u obzir snagu od 80% i pretpostavljajući dvostranu razinu značajnosti od 5%, odredili smo preliminarnu veličinu uzorka (n = 5 na temelju prethodne literature) koja je odgovarala standardiziranoj veličini učinka od 2,02 s unaprijed definiranom vrijednošću koju je predložio Festing za izračun veličine uzorka eksperimentalnih životinja35. Nakon množenja ove vrijednosti sa SD (2,02 × 0,81), predviđena veličina detektabilnog učinka (1,6 μM) bila je 20%, što je prihvatljivo. To znači da je n = 5/skupina dovoljna za otkrivanje 20%-tne srednje promjene između skupina. Štakori su nasumično podijeljeni u kontrolne i skupine tretirane NaSH-om pomoću funkcije slučajnog odabira Excel softvera36 (Dodatna slika 1). Zasljepljivanje je provedeno na razini ishoda, a istraživači koji su provodili biokemijska mjerenja nisu bili svjesni raspodjela skupina.
Skupine oba spola koje su primale NaHS tretirane su s 30 μM otopinom NaHS pripremljenom u vodi za piće tijekom 2 tjedna; svježa otopina davana je svakih 24 sata, tijekom kojih je mjerena tjelesna težina. Uzorci krvi prikupljeni su s vrhova repova svih štakora pod izofluranskom anestezijom svaki drugi dan na kraju prvog i drugog tjedna. Uzorci krvi centrifugirani su na 3000 g tijekom 10 minuta, serum je odvojen i pohranjen na –80°C za naknadno mjerenje uree u serumu, kreatinina (Cr) i ukupnog sulfida. Urea u serumu određena je enzimskom metodom ureaze, a kreatinin u serumu fotometrijskom Jaffe metodom korištenjem komercijalno dostupnih kompleta (Man Company, Teheran, Iran) i automatskog analizatora (Selectra E, serijski broj 0-2124, Nizozemska). Intra- i inter-analitički koeficijenti varijacije za ureu i Cr bili su manji od 2,5%.
Metoda metilenskog plavog (MB) koristi se za mjerenje ukupnog sulfida u vodi za piće i serumu koji sadrži NaHS; MB je najčešće korištena metoda za mjerenje sulfida u rasutim otopinama i biološkim uzorcima11,37. MB metoda može se koristiti za procjenu ukupnog skupa sulfida38 i mjerenje anorganskih sulfida u obliku H2S, HS- i S2 u vodenoj fazi39. U ovoj metodi, sumpor se taloži kao cinkov sulfid (ZnS) u prisutnosti cinkovog acetata11,38. Taloženje cinkovim acetatom najčešće je korištena metoda za odvajanje sulfida od drugih kromofora11. ZnS je ponovno otopljen pomoću HCl11 u jako kiselim uvjetima. Sulfid reagira s DMPD u stehiometrijskom omjeru 1:2 u reakciji kataliziranoj željeznim kloridom (Fe3+ djeluje kao oksidacijsko sredstvo) kako bi se formirala boja MB, koja se spektrofotometrijski detektira na 670 nm40,41. Granica detekcije MB metode je približno 1 μM11.
U ovoj studiji, 100 μL svakog uzorka (otopine ili seruma) dodano je u epruvetu; zatim je dodano 200 μL cinkovog acetata (1% w/v u destiliranoj vodi), 100 μL DMPD-a (20 mM u 7,2 M HCl) i 133 μL FeCl3 (30 mM u 1,2 M HCl). Smjesa je inkubirana na 37°C u mraku tijekom 30 minuta. Otopina je centrifugirana na 10 000 g tijekom 10 minuta, a apsorbancija supernatanta očitana je na 670 nm pomoću čitača mikroploča (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, SAD). Koncentracije sulfida određene su pomoću kalibracijske krivulje NaHS (0–100 μM) u ddH2O (Dodatna slika 2). Sve otopine korištene za mjerenja bile su svježe pripremljene. Koeficijenti varijacije unutar i između testova za mjerenja sulfida bili su 2,8% odnosno 3,4%. Također smo odredili ukupni sulfid izoliran iz uzoraka vode za piće i seruma koji sadrže natrijev tiosulfat koristeći metodu obogaćenog uzorka42. Iskorištenje za uzorke vode za piće i seruma koji sadrže natrijev tiosulfat bilo je 91 ± 1,1% (n = 6) odnosno 93 ± 2,4% (n = 6).
Statistička analiza provedena je korištenjem GraphPad Prism softvera verzije 8.0.2 za Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD, www.graphpad.com). Za usporedbu temperature i pH vode za piće prije i nakon dodavanja NaHS korišten je t-test za uparivanje. Gubitak H2S u otopini koja sadrži NaHS izračunat je kao postotak smanjenja od početne vrijednosti apsorpcije, a kako bismo procijenili je li gubitak statistički značajan, proveli smo jednosmjernu ANOVA s ponovljenim mjerenjima, nakon čega je uslijedio Dunnettov test višestruke usporedbe. Tjelesna težina, serumska urea, serumski kreatinin i ukupni serumski sulfid tijekom vremena uspoređeni su između kontrolnih i štakora tretiranih NaHS-om različitih spolova korištenjem dvosmjerne miješane (između-unutar) ANOVA, nakon čega je uslijedio Bonferroni post hoc test. Dvostrane P vrijednosti < 0,05 smatrane su statistički značajnima.
pH vrijednost vode za piće bila je 7,60 ± 0,01 prije dodavanja NaHS i 7,71 ± 0,03 nakon dodavanja NaHS (n = 13, p = 0,0029). Temperatura vode za piće bila je 26,5 ± 0,2 i smanjila se na 26,2 ± 0,2 nakon dodavanja NaHS (n = 13, p = 0,0128). Pripremite otopinu NaHS od 30 μM u vodi za piće i pohranite je u bocu za vodu. Otopina NaHS je nestabilna i njezina koncentracija se s vremenom smanjuje. Prilikom uzorkovanja iz grla boce za vodu, uočeno je značajno smanjenje (68,0%) unutar prvog sata, a sadržaj NaHS u otopini smanjio se za 72% odnosno 75% nakon 12 odnosno 24 sata. U uzorcima dobivenim iz boca za vodu smanjenje NaHS nije bilo značajno do 2 sata, ali nakon 12 i 24 sata smanjilo se za 47% odnosno 72%. Ovi podaci pokazuju da se postotak NaHS u otopini od 30 μM pripremljenoj u vodi za piće smanjio na približno jednu četvrtinu početne vrijednosti nakon 24 sata, bez obzira na mjesto uzorkovanja (Slika 1).
Stabilnost otopine NaHS (30 μM) u vodi za piće u bocama za štakore/miševe. Nakon pripreme otopine, uzorci su uzeti s vrha i unutrašnjosti boce za vodu. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD (n = 6/skupina). * i #, P < 0,05 u usporedbi s vremenom 0. Fotografija boce za vodu prikazuje vrh (s otvorom) i tijelo boce. Volumen vrha je približno 740 μL.
Koncentracija NaHS u svježe pripremljenoj otopini od 30 μM bila je 30,3 ± 0,4 μM (raspon: 28,7–31,9 μM, n = 12). Međutim, nakon 24 sata, koncentracija NaHS smanjila se na nižu vrijednost (srednja vrijednost: 3,0 ± 0,6 μM). Kao što je prikazano na slici 2, koncentracije NaHS kojima su štakori bili izloženi nisu bile konstantne tijekom razdoblja istraživanja.
Tjelesna težina ženki štakora značajno se povećala tijekom vremena (s 205,2 ± 5,2 g na 213,8 ​​± 7,0 g u kontrolnoj skupini i s 204,0 ± 8,6 g na 211,8 ± 7,5 g u skupini tretiranoj NaHS-om); međutim, tretman NaHS-om nije imao učinka na tjelesnu težinu (slika 3). Tjelesna težina mužjaka štakora značajno se povećala tijekom vremena (s 338,6 ± 8,3 g na 352,4 ± 6,0 g u kontrolnoj skupini i s 352,4 ± 5,9 g na 363,2 ± 4,3 g u skupini tretiranoj NaHS-om); međutim, tretman NaHS-om nije imao učinka na tjelesnu težinu (slika 3).
Promjene tjelesne težine u ženki i mužjaka štakora nakon primjene NaHS (30 μM). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM i uspoređeni su korištenjem dvosmjerne miješane (između-unutarnje) analize varijance s Bonferronijevim post hoc testom. n = 5 svakog spola u svakoj skupini.
Koncentracije uree i kreatin fosfata u serumu bile su usporedive kod kontrolnih i štakora tretiranih NaSH-om tijekom cijele studije. Nadalje, tretman NaSH-om nije utjecao na koncentracije uree i kreatin kroma u serumu (Tablica 1).
Osnovne koncentracije ukupnog sulfida u serumu bile su usporedive između kontrolnih i muških (8,1 ± 0,5 μM prema 9,3 ± 0,2 μM) i ženki (9,1 ± 1,0 μM prema 6,1 ± 1,1 μM) štakora tretiranih NaHS-om. Primjena NaHS-a tijekom 14 dana nije imala učinka na razinu ukupnog sulfida u serumu ni kod mužjaka ni kod ženki štakora (slika 4).
Promjene u ukupnim koncentracijama sulfida u serumu kod mužjaka i ženki štakora nakon primjene NaHS (30 μM). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM i uspoređeni su korištenjem dvosmjerne miješane (unutar-unutar) analize varijance s Bonferronijevim post hoc testom. Svaki spol, n = 5/skupina.
Glavni zaključak ove studije je da je voda za piće koja sadrži NaHS nestabilna: samo oko četvrtine početnog ukupnog sadržaja sulfida može se otkriti 24 sata nakon uzorkovanja s vrha i unutrašnjosti boca za vodu za štakore/miševe. Nadalje, štakori su bili izloženi nestabilnim koncentracijama NaHS zbog gubitka H2S u otopini NaHS, a dodatak NaHS u vodu za piće nije utjecao na tjelesnu težinu, serumsku ureu i kreatin krom, niti na ukupni serumski sulfid.
U ovoj studiji, brzina gubitka H2S iz otopina NaHS koncentracije 30 μM pripremljenih u vodi za piće bila je približno 3% na sat. U puferiranoj otopini (100 μM natrijev sulfid u 10 mM PBS, pH 7,4), zabilježeno je da se koncentracija sulfida smanjila za 7% tijekom 8 sati11. Prethodno smo branili intraperitonealnu primjenu NaHS izvješćujući da je brzina gubitka sulfida iz otopine NaHS koncentracije 54 μM u vodi za piće bila približno 2,3% na sat (4%/sat u prvih 12 sati i 1,4%/sat u posljednjih 12 sati nakon pripreme)8. Ranije studije43 otkrile su konstantan gubitak H2S iz otopina NaHS, prvenstveno zbog isparavanja i oksidacije. Čak i bez dodavanja mjehurića, sulfid u osnovnoj otopini se brzo gubi zbog isparavanja H2S11. Studije su pokazale da se tijekom procesa razrjeđivanja, koji traje oko 30-60 sekundi, oko 5-10% H2S gubi zbog isparavanja6. Kako bi spriječili isparavanje H2S iz otopine, istraživači su poduzeli nekoliko mjera, uključujući lagano miješanje otopine12, prekrivanje osnovne otopine plastičnom folijom6 i minimiziranje izlaganja otopine zraku, budući da brzina isparavanja H2S ovisi o granici zrak-tekućina.13 Spontana oksidacija H2S događa se uglavnom zbog iona prijelaznih metala, posebno željeza (III), koji su nečistoće u vodi.13 Oksidacija H2S rezultira stvaranjem polisulfida (atomi sumpora povezani kovalentnim vezama)11. Kako bi se izbjegla njegova oksidacija, otopine koje sadrže H2S pripremaju se u deoksigeniranim otapalima44,45, a zatim se pročišćavaju argonom ili dušikom 20-30 minuta kako bi se osigurala deoksigenacija.11,12,37,44,45,46 Dietilentriaminpentaoctena kiselina (DTPA) je kelator metala (10-4 M) koji sprječava autooksidaciju HS u aerobnim otopinama. U odsutnosti DTPA, brzina autooksidacije HS- je približno 50% tijekom približno 3 sata na 25°C37,47. Nadalje, budući da je oksidacija 1e-sulfida katalizirana ultraljubičastim svjetlom, otopinu treba čuvati na ledu i zaštititi od svjetlosti11.
Kao što je prikazano na slici 5, NaHS disocira na Na+ i HS-6 kada se otopi u vodi; ta disocijacija određena je pK1 reakcije, koji ovisi o temperaturi: pK1 = 3,122 + 1132/T, gdje se T kreće od 5 do 30 °C i mjeri se u stupnjevima Kelvina (K), K = °C + 273,1548. HS- ima visoki pK2 (pK2 = 19), pa se pri pH < 96,49 S2- ne stvara ili se stvara u vrlo malim količinama. Nasuprot tome, HS- djeluje kao baza i prihvaća H+ iz molekule H2O, a H2O djeluje kao kiselina i pretvara se u H2S i OH-.
Stvaranje otopljenog plina H2S u otopini NaHS (30 µM). aq, vodena otopina; g, plin; l, tekućina. Svi izračuni pretpostavljaju da je pH vode = 7,0 i temperatura vode = 20 °C. Izrađeno s BioRender.com.
Unatoč dokazima da su otopine NaHS nestabilne, nekoliko studija na životinjama koristilo je otopine NaHS u vodi za piće kao spoj donor H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 s trajanjem intervencije u rasponu od 1 do 21 tjedna (Tablica 2). Tijekom ovih studija, otopina NaHS obnavljala se svakih 12 sati, 15, 17, 18, 24, 25 sati ili 24 sata, 19, 20, 21, 22, 23 sata. Naši rezultati pokazali su da su štakori bili izloženi nestabilnim koncentracijama lijeka zbog gubitka H2S iz otopine NaHS, a sadržaj NaHS u vodi za piće štakora značajno je fluktuirao tijekom 12 ili 24 sata (vidi Sliku 2). Dvije od ovih studija izvijestile su da su razine H2S u vodi ostale stabilne tijekom 24 sata22 ili da su uočeni samo gubici H2S od 2-3% tijekom 12 sati15, ali nisu pružile potkrepljujuće podatke ili detalje mjerenja. Dvije studije pokazale su da mali promjer boca za vodu može smanjiti isparavanje H2S15,19. Međutim, naši rezultati pokazali su da to može odgoditi gubitak H2S iz boce za vodu samo za 2 sata, a ne za 12-24 sata. Obje studije napominju da pretpostavljamo da se razina NaHS u vodi za piće nije promijenila jer nismo uočili promjenu boje vode; stoga oksidacija H2S zrakom nije bila značajna19,20. Iznenađujuće, ova subjektivna metoda procjenjuje stabilnost NaHS u vodi, a ne mjeri promjenu njegove koncentracije tijekom vremena.
Gubitak H2S u otopini NaHS povezan je s pH vrijednošću i temperaturom. Kao što je navedeno u našoj studiji, otapanje NaHS u vodi rezultira stvaranjem alkalne otopine50. Kada se NaHS otopi u vodi, stvaranje otopljenog plina H2S ovisi o pH vrijednosti6. Što je niži pH otopine, to je veći udio NaHS prisutnog kao molekule plina H2S i više se sulfida gubi iz vodene otopine11. Niti jedna od ovih studija nije izvijestila o pH vrijednosti vode za piće koja se koristi kao otapalo za NaHS. Prema preporukama WHO-a, koje usvaja većina zemalja, pH vode za piće trebao bi biti u rasponu od 6,5 do 8,551. U ovom rasponu pH, brzina spontane oksidacije H2S povećava se otprilike deset puta13. Otapanje NaHS u vodi u ovom rasponu pH rezultirat će koncentracijom otopljenog plina H2S od 1 do 22,5 μM, što naglašava važnost praćenja pH vrijednosti vode prije otapanja NaHS. Osim toga, temperaturni raspon naveden u gornjoj studiji (18–26 °C) rezultirao bi promjenom koncentracije otopljenog plina H2S u otopini od približno 10%, budući da promjene temperature mijenjaju pK1, a male promjene pK1 mogu imati značajan utjecaj na koncentraciju otopljenog plina H2S48. Osim toga, dugo trajanje nekih studija (5 mjeseci)22, tijekom kojih se očekuje velika varijabilnost temperature, također pogoršava ovaj problem.
Sve studije osim jedne21 koristile su otopinu NaHS od 30 μM u vodi za piće. Kako bi objasnili korištenu dozu (tj. 30 μM), neki su autori istaknuli da NaHS u vodenoj fazi proizvodi potpuno istu koncentraciju plina H2S te da je fiziološki raspon H2S od 10 do 100 μM, pa je ta doza unutar fiziološkog raspona15,16. Drugi su objasnili da 30 μM NaHS može održavati razinu H2S u plazmi unutar fiziološkog raspona, tj. 5–300 μM19,20. Uzimamo u obzir koncentraciju NaHS u vodi od 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), koja je korištena u nekim studijama za proučavanje učinaka H2S. Možemo izračunati da je koncentracija otopljenog plina H2S 14,7 μM, što je oko 50% početne koncentracije NaHS. Ova je vrijednost slična vrijednosti koju su izračunali drugi autori pod istim uvjetima13,48.
U našoj studiji, primjena NaHS-a nije promijenila tjelesnu težinu; ovaj rezultat je u skladu s rezultatima drugih studija na mužjacima miševa22,23 i mužjacima štakora18; Međutim, dvije studije su izvijestile da je NaSH obnovio smanjenu tjelesnu težinu kod nefrektomiranih štakora24,26, dok druge studije nisu izvijestile o učinku primjene NaSH-a na tjelesnu težinu15,16,17,19,20,21,25. Nadalje, u našoj studiji, primjena NaSH-a nije utjecala na razinu uree i kreatin-kroma u serumu, što je u skladu s rezultatima drugog izvješća25.
Studija je otkrila da dodavanje NaHS u vodu za piće tijekom 2 tjedna nije utjecalo na ukupne koncentracije sulfida u serumu kod mužjaka i ženki štakora. Ovaj nalaz je u skladu s rezultatima Sen i sur. (16): 8 tjedana tretmana s 30 μM NaHS u vodi za piće nije utjecalo na razinu sulfida u plazmi kod kontrolnih štakora; međutim, izvijestili su da je ova intervencija obnovila smanjene razine H2S u plazmi nefrektomiranih miševa. Li i sur. (22) također su izvijestili da je tretman s 30 μM NaHS u vodi za piće tijekom 5 mjeseci povećao razinu slobodnog sulfida u plazmi kod starijih miševa za oko 26%. Druge studije nisu izvijestile o promjenama u cirkulirajućem sulfidu nakon dodavanja NaHS u vodu za piće.
Sedam studija izvijestilo je o korištenju Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, ali nisu pružile daljnje detalje o hidratacijskoj vodi, a pet studija nije spomenulo izvor NaHS korištenog u njihovim metodama pripreme17,18,24,25,26. NaHS je hidratizirana molekula i njezin sadržaj hidratacijske vode može varirati, što utječe na količinu NaHS potrebnu za pripremu otopine dane molarnosti. Na primjer, sadržaj NaHS u našoj studiji bio je NaHS•1,3 H2O. Stoga stvarne koncentracije NaHS u tim studijama mogu biti niže od onih koje su navedene.
„Kako tako kratkotrajni spoj može imati tako dugotrajan učinak?“ Pozgay i sur.21 postavili su ovo pitanje prilikom procjene učinaka NaHS na kolitis kod miševa. Nadaju se da će buduće studije moći odgovoriti na ovo pitanje i nagađaju da otopine NaHS mogu sadržavati stabilnije polisulfide uz H2S i disulfide koji posreduju učinak NaHS21. Druga mogućnost je da vrlo niske koncentracije NaHS koje ostaju u otopini također mogu imati blagotvoran učinak. Zapravo, Olson i sur. pružili su dokaze da mikromolarne razine H2S u krvi nisu fiziološke i da bi trebale biti u nanomolarnom rasponu ili potpuno odsutne13. H2S može djelovati putem sulfacije proteina, reverzibilne posttranslacijske modifikacije koja utječe na funkciju, stabilnost i lokalizaciju mnogih proteina52,53,54. Zapravo, u fiziološkim uvjetima, približno 10% do 25% mnogih proteina jetre je sulfilirano53. Obje studije priznaju brzo uništavanje NaHS19,23 ali iznenađujuće navode da smo „kontrolirali koncentraciju NaHS u vodi za piće tako što smo ga svakodnevno zamjenjivali.“23 Jedna studija slučajno je navela da je „NaHS standardni donor H2S i da se često koristi u kliničkoj praksi za zamjenu samog H2S.“18
Gornja rasprava pokazuje da se NaHS gubi iz otopine isparavanjem, oksidacijom i fotolizom, te su stoga dani neki prijedlozi za smanjenje gubitka H2S iz otopine. Prvo, isparavanje H2S ovisi o granici plin-tekućina13 i pH otopine11; stoga, kako bi se smanjio gubitak isparavanjem, grlo boce za vodu može se napraviti što manjim, kao što je prethodno opisano15,19, a pH vode može se podesiti na prihvatljivu gornju granicu (tj. 6,5–8,551) kako bi se smanjio gubitak isparavanjem11. Drugo, spontana oksidacija H2S događa se zbog učinaka kisika i prisutnosti iona prijelaznih metala u vodi za piće13, pa deoksigenacija vode za piće argonom ili dušikom44,45 i upotreba kelatora metala37,47 mogu smanjiti oksidaciju sulfida. Treće, kako bi se spriječila fotodekompozicija H2S, boce za vodu mogu se omotati aluminijskom folijom; Ova se praksa odnosi i na materijale osjetljive na svjetlost poput streptozotocina55. Konačno, anorganske sulfidne soli (NaHS, Na2S i CaS) mogu se davati putem gavaže, umjesto da se otopi u vodi za piće, kako je prethodno objavljeno56,57,58; studije su pokazale da se radioaktivni natrijev sulfid primijenjen putem gavaže štakorima dobro apsorbira i distribuira u gotovo sva tkiva59. Do danas je većina studija davala anorganske sulfidne soli intraperitonealno; međutim, ovaj se put rijetko koristi u kliničkim uvjetima60. S druge strane, oralni put je najčešći i preferirani put primjene kod ljudi61. Stoga preporučujemo procjenu učinaka donora H2S kod glodavaca oralnom gavažom.
Ograničenje je to što smo sulfid u vodenoj otopini i serumu mjerili MB metodom. Metode za mjerenje sulfida uključuju titraciju joda, spektrofotometriju, elektrokemijsku metodu (potenciometrija, amperometrija, kulometrijska metoda i amperometrijska metoda) i kromatografiju (plinska kromatografija i visokoučinkovita tekućinska kromatografija), među kojima je najčešće korištena metoda MB spektrofotometrijska metoda62. Ograničenje MB metode za mjerenje H2S u biološkim uzorcima je to što mjeri sve spojeve koji sadrže sumpor, a ne slobodni H2S63 jer se provodi u kiselim uvjetima, što rezultira ekstrakcijom sumpora iz biološkog izvora64. Međutim, prema Američkom udruženju za javno zdravstvo, MB je standardna metoda za mjerenje sulfida u vodi65. Stoga ovo ograničenje ne utječe na naše glavne rezultate o nestabilnosti otopina koje sadrže NaHS. Nadalje, u našoj studiji, oporavak mjerenja sulfida u uzorcima vode i seruma koji sadrže NaHS bio je 91% odnosno 93%. Ove vrijednosti su u skladu s prethodno objavljenim rasponima (77–92)66, što ukazuje na prihvatljivu analitičku preciznost42. Vrijedi napomenuti da smo koristili i mužjake i ženke štakora u skladu sa smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje (NIH) kako bismo izbjegli pretjerano oslanjanje na studije na životinjama samo na mužjacima u predkliničkim studijama67 te kako bismo uključili i mužjake i ženke štakora kad god je to moguće68. Ovu su točku naglasili i drugi69,70,71.
Zaključno, rezultati ove studije pokazuju da se otopine NaHS pripremljene od vode za piće ne mogu koristiti za stvaranje H2S zbog njihove nestabilnosti. Ovaj put primjene izložio bi životinje nestabilnim i nižim od očekivanih razina NaHS; stoga se nalazi možda ne mogu primijeniti na ljude.
Skupovi podataka korišteni i/ili analizirani tijekom ove studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.
Szabo, K. Vremenska crta istraživanja vodikovog sulfida (H2S): od toksina iz okoliša do biološkog medijatora. Biokemija i farmakologija 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. i Kimura, H. Moguća uloga sumporovodika kao endogenog neuromodulatora. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. i Papapetropoulos, A. Fiziološka uloga sumporovodika u stanicama, tkivima i organima sisavaca. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB i Kashfi, K. Razvoj obećanja staničnih sustava za isporuku dušikovog oksida i vodikovog sulfida: nova era personalizirane medicine. Biokemija i farmakologija 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. i dr. Dugotrajna primjena donora vodikovog sulfida s polaganim oslobađanjem može spriječiti ishemiju/reperfuzijsku ozljedu miokarda. Znanstvena izvješća 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM i Hermann, A. Fosforilacija BK kanala regulira osjetljivost na vodikov sulfid (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM i Hermann, A. Vodikov sulfid pojačava aktivnost kalcijem aktiviranih kalijevih (BK) kanala u stanicama tumora hipofize štakora. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S. i dr. Sumporovodik pojačava zaštitni učinak nitrita protiv ishemijsko-reperfuzijske ozljede miokarda kod štakora s dijabetesom tipa 2. Dušikov oksid 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A. i dr. Trendovi u kemiji donora H2S i njegov utjecaj na kardiovaskularne bolesti. Antioksidansi 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF i Olson, KR (2012). Pasivni gubici sumporovodika u biološkim eksperimentima. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P. i dr. Kemijski aspekti mjerenja vodikovog sulfida u fiziološkim uzorcima. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Spektrofotometrijsko određivanje sumporovodika u prirodnim vodama. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Praktična obuka iz kemije i biologije sumporovodika. „Antioksidansi.“ Redoks signalizacija. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).