Prethodno smo izvijestili da su serumske razine metabolita triptofana iz crijeva, indol-3-propionske kiseline (IPA), niže kod pacijenata s fibrozom jetre. U ovoj studiji istražili smo transkriptom i DNA metilom u pretilim jetrama u odnosu na serumske razine IPA, kao i ulogu IPA u induciranju fenotipske inaktivacije jetrenih zvjezdastih stanica (HSC) in vitro.
U studiju je uključeno 116 pretilih pacijenata bez šećerne bolesti tipa 2 (DM2) (dob 46,8 ± 9,3 godine; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) koji su podvrgnuti barijatrijskoj operaciji u Centru za barijatrijsku kirurgiju Kuopio (KOBS). Razine IPA u cirkulaciji mjerene su tekućinskom kromatografijom-masenom spektrometrijom (LC-MS), analiza transkriptoma jetre provedena je sekvenciranjem ukupne RNA, a analiza metilacije DNA provedena je pomoću Infinium HumanMethylation450 BeadChip-a. Za in vitro eksperimente korištene su ljudske zvjezdaste stanice jetre (LX-2).
Serumske razine IPA korelirale su s ekspresijom gena uključenih u apoptotske, mitofagne i putove dugovječnosti u jetri. Gen AKT serin/treonin kinaza 1 (AKT1) bio je najzastupljeniji i dominantni gen koji je interagirao u profilima transkripta jetre i metilacije DNA. Liječenje IPA-om izazvalo je apoptozu, smanjilo mitohondrijalno disanje te promijenilo staničnu morfologiju i mitohondrijsku dinamiku modulirajući ekspresiju gena za koje se zna da reguliraju fibrozu, apoptozu i preživljavanje LX-2 stanica.
Uzeti zajedno, ovi podaci podupiru tvrdnju da IPA ima potencijalne terapijske učinke i može izazvati apoptozu te pomaknuti HSC fenotip prema neaktivnom stanju, čime se proširuje mogućnost inhibicije fibroze jetre ometanjem aktivacije HSC-a i metabolizma mitohondrija.
Prevalencija pretilosti i metaboličkog sindroma povezana je s rastućom učestalošću metabolički povezane masne bolesti jetre (MASLD); bolest pogađa 25% do 30% opće populacije [1]. Glavna posljedica etiologije MASLD-a je fibroza jetre, dinamičan proces karakteriziran kontinuiranim nakupljanjem vlaknastog izvanstaničnog matriksa (ECM) [2]. Glavne stanice uključene u fibrozu jetre su jetrene zvjezdaste stanice (HSC), koje pokazuju četiri poznata fenotipa: mirujuće, aktivirane, inaktivirane i senescentne [3, 4]. HSC se mogu aktivirati i transdiferencirati iz mirujućeg oblika u proliferativne stanice slične fibroblastima s visokim energetskim potrebama, s povećanom ekspresijom α-glatkog mišićnog aktina (α-SMA) i kolagena tipa I (Col-I) [5, 6]. Tijekom preokreta fibroze jetre, aktivirane HSC se eliminiraju putem apoptoze ili inaktivacije. Ti procesi uključuju smanjenje fibrogenih gena i modulaciju gena koji potiču preživljavanje (kao što su signalni putevi NF-κB i PI3K/Akt) [7, 8], kao i promjene u dinamici i funkciji mitohondrija [9].
Serumske razine metabolita triptofana, indol-3-propionske kiseline (IPA), koji se proizvodi u crijevima, smanjene su kod metaboličkih bolesti kod ljudi, uključujući MASLD [10–13]. IPA je povezan s unosom dijetalnih vlakana, poznat je po svojim antioksidativnim i protuupalnim učincima te ublažava fenotip nealkoholnog steatohepatitisa (NASH) induciranog prehranom in vivo i in vitro [11–14]. Neki dokazi potječu iz naše prethodne studije, koja je pokazala da su serumske razine IPA bile niže kod pacijenata s fibrozom jetre nego kod pretilih pacijenata bez fibroze jetre u studiji Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Nadalje, pokazali smo da liječenje IPA-om može smanjiti ekspresiju gena koji su klasični markeri stanične adhezije, migracije stanica i aktivacije hematopoetskih matičnih stanica u modelu ljudskih zvjezdastih stanica jetre (LX-2) te da je potencijalni hepatoprotektivni metabolit [15]. Međutim, ostaje nejasno kako IPA inducira regresiju fibroze jetre aktiviranjem apoptoze HSC-a i mitohondrijske bioenergetike.
Ovdje pokazujemo da je serumski IPA povezan s ekspresijom gena obogaćenih apoptozom, mitofagijom i putovima dugovječnosti u jetri pretilih osoba koje nemaju dijabetes tipa 2 (KOBS). Nadalje, otkrili smo da IPA može inducirati uklanjanje i razgradnju aktiviranih hematopoetskih matičnih stanica (HSC) putem puta inaktivacije. Ovi rezultati otkrivaju novu ulogu IPA, što ga čini potencijalnom terapijskom metom za poticanje regresije fibroze jetre.
Prethodna studija u KOBS kohorti pokazala je da pacijenti s fibrozom jetre imaju niže razine IPA u cirkulaciji u usporedbi s pacijentima bez fibroze jetre [15]. Kako bismo isključili potencijalni zbunjujući učinak dijabetesa tipa 2, uključili smo 116 pretilih pacijenata bez dijabetesa tipa 2 (prosječna dob ± SD: 46,8 ± 9,3 godine; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tablica 1) iz tekuće KOBS studije kao populaciju za ispitivanje [16]. Svi sudionici dali su pisani informirani pristanak, a protokol studije odobrio je Etički odbor bolnice okruga North Savo u skladu s Helsinškom deklaracijom (54/2005, 104/2008 i 27/2010).
Uzorci biopsije jetre dobiveni su tijekom barijatrijske kirurgije i histološki su ih procijenili iskusni patolozi prema prethodno opisanim kriterijima [17, 18]. Kriteriji procjene sažeti su u Dodatnoj tablici S1 i prethodno su opisani [19].
Uzorci seruma natašte analizirani su neciljanom tekućinskom kromatografijom-masenom spektrometrijom (LC-MS) za metabolomsku analizu (n = 116). Uzorci su analizirani korištenjem UHPLC-qTOF-MS sustava (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Njemačka) kako je prethodno opisano19. Identifikacija izopropilnog alkohola (IPA) temeljila se na vremenu zadržavanja i usporedbi MS/MS spektra s čistim standardima. Intenzitet IPA signala (površina vrha) uzet je u obzir u svim daljnjim analizama [20].
Sekvenciranje cijele jetrene RNA provedeno je pomoću Illumina HiSeq 2500, a podaci su prethodno obrađeni kako je prethodno opisano [19, 21, 22]. Provedena je ciljana analiza diferencijalne ekspresije transkripata koji utječu na mitohondrijsku funkciju/biogenezu koristeći 1957 gena odabranih iz baze podataka MitoMiner 4.0 [23]. Analiza metilacije jetrene DNA provedena je pomoću Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, SAD) koristeći istu metodologiju kao što je prethodno opisano [24, 25].
Ljudske zvjezdaste stanice jetre (LX-2) ljubazno je ustupio prof. Stefano Romeo te su uzgajane i održavane u DMEM/F12 mediju (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Kako bi se odabrala radna doza IPA, stanice LX-2 tretirane su različitim koncentracijama IPA (10 μM, 100 μM i 1 mM; Sigma, 220027) u DMEM/F12 mediju tijekom 24 sata. Nadalje, kako bi se istražila sposobnost IPA da inaktivira HSC-e, stanice LX-2 su istovremeno tretirane s 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) i 1 mM IPA u mediju bez seruma tijekom 24 sata. Za odgovarajuće kontrole s vehikulumom, 4 nM HCl koji sadrži 0,1% BSA korišten je za tretman s TGF-β1, a 0,05% DMSO korišteno je za tretman s IPA, a oba su korištena zajedno za kombinirani tretman.
Apoptoza je procijenjena korištenjem FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit-a sa 7-AAD-om (Biolegend, San Diego, CA, SAD, kat. br. 640922) prema uputama proizvođača. Ukratko, LX-2 (1 × 105 stanica/jažici) uzgajane su preko noći u pločama s 12 jažica, a zatim tretirane s višestrukim dozama IPA ili IPA i TGF-β1. Sljedećeg dana, plutajuće i prianjajuće stanice su sakupljene, tripsinizirane, isprane s PBS-om, resuspendirane u puferu za vezanje Aneksina V i inkubirane s FITC-Aneksinom V i 7-AAD-om tijekom 15 minuta.
Mitohondrije u živim stanicama obojene su na oksidativnu aktivnost pomoću Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Za MTR testove, LX-2 stanice inkubirane su pri jednakim gustoćama s IPA i TGF-β1. Nakon 24 sata, žive stanice su tripsinizirane, isprane s PBS-om, a zatim inkubirane sa 100 μM MTR u mediju bez seruma na 37 °C tijekom 20 minuta kako je prethodno opisano [26]. Za analizu morfologije živih stanica, veličina stanica i citoplazmatska složenost analizirane su pomoću parametara raspršenja unaprijed (FSC) i raspršenja u stranu (SSC).
Svi podaci (30 000 događaja) prikupljeni su pomoću NovoCyte Quanteon (Agilent) i analizirani pomoću softvera NovoExpress® 1.4.1 ili FlowJo V.10.
Brzina potrošnje kisika (OCR) i brzina izvanstanične acidifikacije (ECAR) mjerene su u stvarnom vremenu pomoću Seahorse Extracellular Flux Analyzera (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) opremljenog Seahorse XF Cell Mito Stress uređajem prema uputama proizvođača. Ukratko, 2 × 10⁴ LX-2 stanica/jažici posijano je na XF96 ploče za staničnu kulturu. Nakon inkubacije preko noći, stanice su tretirane izopropanolom (IPA) i TGF-β1 (Dodatne metode 1). Analiza podataka provedena je pomoću Seahorse XF Wave softvera, koji uključuje Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Iz toga je izračunat bioenergetski indeks zdravlja (BHI) [27].
Ukupna RNA je transkribirana u cDNA. Za specifične metode, vidi referencu [15]. Razine mRNA ljudskog 60S ribosomskog kiselog proteina P0 (RPLP0) i ciklofilina A1 (PPIA) korištene su kao konstitutivne kontrole gena. Korišten je QuantStudio 6 pro Real-Time PCR sustav (Thermo Fisher, Landsmeer, Nizozemska) s TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kitom (Applied Biosystems) ili Sensifast SYBR Lo-ROX Kitom (Bioline, BIO 94050), a relativni omjer ekspresije gena izračunat je korištenjem komparativnih parametara ciklusa Ct vrijednosti (ΔΔCt) i metode ∆∆Ct. Pojedinosti o primerima navedene su u dodatnim tablicama S2 i S3.
Nuklearna DNA (ncDNA) i mitohondrijska DNA (mtDNA) ekstrahirane su pomoću DNeasy kompleta za krv i tkivo (Qiagen) kako je prethodno opisano [28]. Relativna količina mtDNA izračunata je izračunom omjera svake ciljne regije mtDNA i geometrijske sredine triju regija nuklearne DNA (mtDNA/ncDNA), kako je detaljno opisano u Dodatnim metodama 2. Pojedinosti o primerima za mtDNA i ncDNA navedene su u Dodatnoj tablici S4.
Žive stanice obojene su s Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) kako bi se vizualizirale međustanične i unutarstanične mitohondrijske mreže. LX-2 stanice (1 × 10⁴ stanica/jažici) uzgajane su na staklenim pločicama u odgovarajućim pločama za kulturu sa staklenim dnom (Ibidi GmbH, Martinsried, Njemačka). Nakon 24 sata, žive LX-2 stanice inkubirane su sa 100 μM MTR tijekom 20 minuta na 37 °C, a stanične jezgre obojene su s DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) kako je prethodno opisano [29]. Mitohondrijalne mreže vizualizirane su pomoću inverznog mikroskopa Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Njemačka) opremljenog konfokalnim modulom Zeiss LSM 800 na 37 °C u vlažnoj atmosferi s 5% CO2 korištenjem objektiva 63×NA 1.3. Dobili smo deset slika Z-serije za svaku vrstu uzorka. Svaka Z-serija sadrži 30 presjeka, svaki debljine 9,86 μm. Za svaki uzorak snimljene su slike deset različitih vidnih polja pomoću ZEN 2009 softvera (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Njemačka), a analiza mitohondrijske morfologije provedena je pomoću ImageJ softvera (v1.54d) [30, 31] prema parametrima detaljno opisanim u Dodatnim metodama 3.
Stanice su fiksirane s 2% glutaraldehidom u 0,1 M fosfatnom puferu, nakon čega je slijedila fiksacija s 1% otopinom osmijevog tetroksida (Sigma Aldrich, MO, SAD), postupno dehidrirane acetonom (Merck, Darmstadt, Njemačka) i konačno ugrađene u epoksidnu smolu. Pripremljeni su ultratanki rezovi i obojeni s 1% uranil acetatom (Merck, Darmstadt, Njemačka) i 1% olovnim citratom (Merck, Darmstadt, Njemačka). Ultrastrukturne slike dobivene su pomoću transmisijskog elektronskog mikroskopa JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokio, Japan) pri ubrzavajućem naponu od 80 kV.
Morfologija LX-2 stanica tretiranih s IPA tijekom 24 sata analizirana je fazno-kontrastnom mikroskopijom pri povećanju od 50x korištenjem Zeiss inverznog svjetlosnog mikroskopa (Zeiss Axio Vert.A1 i AxioCam MRm, Jena, Njemačka).
Klinički podaci izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija ili medijan (interkvartilni raspon: IQR). Za usporedbu razlika između tri studijske skupine korištena je jednosmjerna analiza varijance (kontinuirane varijable) ili χ² test (kategoričke varijable). Stopa lažno pozitivnih rezultata (FDR) korištena je za korekciju višestrukog testiranja, a geni s FDR < 0,05 smatrani su statistički značajnima. Spearmanova korelacijska analiza korištena je za korelaciju metilacije CpG DNA s intenzitetom IPA signala, s prijavljenim nominalnim p vrijednostima (p < 0,05).
Analiza genskog puta provedena je korištenjem web-baziranog alata za analizu genskog skupa (WebGestalt) za 268 transkripata (nominalni p < 0,01), 119 transkripata povezanih s mitohondrijima (nominalni p < 0,05) i 4350 CpG od 3093 transkripata jetre koji su bili povezani s razinama IPA u cirkulaciji seruma. Za pronalaženje preklapajućih gena korišten je slobodno dostupni alat Venny DB (verzija 2.1.0), a za vizualizaciju interakcija protein-protein korišten je StringDB (verzija 11.5).
Za LX-2 eksperiment, uzorci su testirani na normalnost korištenjem D'Agostino-Pearsonovog testa. Podaci su dobiveni iz najmanje tri biološka ponavljanja i podvrgnuti jednosmjernoj ANOVA s Bonferronijevim post hoc testom. P-vrijednost manja od 0,05 smatrana je statistički značajnom. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD, a broj eksperimenata naznačen je na svakoj slici. Sve analize i grafovi provedeni su korištenjem statističkog softvera GraphPad Prism 8 za Windows (GraphPad Software Inc., verzija 8.4.3, San Diego, SAD).
Prvo smo istražili povezanost razina IPA u serumu s transkriptima jetre, cijelog tijela i mitohondrijima. U ukupnom profilu transkripta, najjači gen povezan s razinama IPA u serumu bio je MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; protein kinaza aktivirana mitogenom 3); u profilu transkripta povezanom s mitohondrijima, najjači povezani gen bio je AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serin/treonin kinaza 1) (Dodatna datoteka 1 i Dodatna datoteka 2).
Zatim smo analizirali globalne transkripte (n = 268; p < 0,01) i transkripte povezane s mitohondrijima (n = 119; p < 0,05), te u konačnici identificirali apoptozu kao najznačajniji kanonski put (p = 0,0089). Za mitohondrijske transkripte povezane s razinama IPA u serumu, usredotočili smo se na apoptozu (FDR = 0,00001), mitofagiju (FDR = 0,00029) i TNF signalne putove (FDR = 0,000006) (Slika 1A, Tablica 2 i Dodatne slike 1A-B).
Analiza preklapanja globalnih, mitohondrijima povezanih transkripata i metilacije DNA u ljudskoj jetri u povezanosti s razinama IPA u serumu. A predstavlja 268 globalnih transkripata, 119 mitohondrijima povezanih transkripata i metilirane DNA transkripata koji su mapirani na 3092 CpG mjesta povezana s razinama IPA u serumu (p vrijednosti < 0,01 za globalne transkripte i metiliranu DNA, te p vrijednosti < 0,05 za mitohondrijalne transkripte). Glavni preklapajući transkripti prikazani su u sredini (AKT1 i YKT6). B Interakcijska karta 13 gena s najvišim rezultatom interakcije (0,900) s drugim genima konstruirana je iz 56 preklapajućih gena (područje crne linije) koji su bili značajno povezani s razinama IPA u serumu pomoću online alata StringDB. Zeleno: Geni mapirani na staničnu komponentu Gene Ontology (GO): mitohondrije (GO:0005739). AKT1 je protein s najvišim rezultatom (0,900) za interakcije s drugim proteinima na temelju podataka (na temelju analize teksta, eksperimenata, baza podataka i koekspresije). Čvorovi mreže predstavljaju proteine, a rubovi predstavljaju veze između proteina.
Budući da metaboliti crijevne mikrobiote mogu regulirati epigenetski sastav putem metilacije DNA [32], istražili smo jesu li razine IPA u serumu povezane s metilacijom DNA u jetri. Otkrili smo da su dva glavna mjesta metilacije povezana s razinama IPA u serumu blizu regije 3 bogate prolin-serinom (C19orf55) i člana 6 obitelji proteina toplinskog šoka B (malog) (HSPB6) (Dodatna datoteka 3). Metilacija DNA 4350 CpG (p < 0,01) bila je korelirana s razinama IPA u serumu i obogaćena je regulatornim putovima dugovječnosti (p = 0,006) (Slika 1A, Tablica 2 i Dodatna slika 1C).
Kako bismo razumjeli biološke mehanizme koji leže u osnovi povezanosti između razina IPA u serumu, globalnih transkripata, transkripata povezanih s mitohondrijima i metilacije DNA u ljudskoj jetri, proveli smo analizu preklapanja gena identificiranih u prethodnoj analizi puta (Slika 1A). Rezultati analize obogaćivanja puta 56 preklapajućih gena (unutar crne linije na Slici 1A) pokazali su da je put apoptoze (p = 0,00029) istaknuo dva gena zajednička za tri analize: AKT1 i YKT6 (homolog YKT6 v-SNARE), kao što je prikazano na Vennovom dijagramu (Dodatna slika 2 i Slika 1A). Zanimljivo je da smo otkrili da su AKT1 (cg19831386) i YKT6 (cg24161647) pozitivno korelirali s razinama IPA u serumu (Dodatna datoteka 3). Kako bismo identificirali potencijalne interakcije proteina između genskih produkata, odabrali smo 13 gena s najvišim rezultatom zajedničke regije (0,900) među 56 preklapajućih gena kao ulaz i konstruirali mapu interakcija. Prema razini pouzdanosti (granična pouzdanost), gen AKT1 s najvišim rezultatom (0,900) bio je na vrhu (Slika 1B).
Na temelju analize putova, otkrili smo da je apoptoza glavni put, stoga smo istražili hoće li tretman IPA utjecati na apoptozu HSC-a in vitro. Prethodno smo pokazali da različite doze IPA (10 μM, 100 μM i 1 mM) nisu toksične za LX-2 stanice [15]. Ova studija pokazala je da tretman IPA-om s 10 μM i 100 μM povećava broj održivih i nekrotičnih stanica. Međutim, u usporedbi s kontrolnom skupinom, održivost stanica smanjila se pri koncentraciji IPA od 1 mM, dok je stopa nekroze stanica ostala nepromijenjena (Slika 2A, B). Zatim, kako bismo pronašli optimalnu koncentraciju za indukciju apoptoze u LX-2 stanicama, testirali smo 10 μM, 100 μM i 1 mM IPA tijekom 24 sata (Slika 2A-E i Dopunska slika 3A-B). Zanimljivo je da su IPA 10 μM i 100 μM smanjili stopu apoptoze (%), međutim, IPA 1 mM povećao je kasnu apoptozu i stopu apoptoze (%) u usporedbi s kontrolom te je stoga odabran za daljnje eksperimente (slike 2A–D).
IPA inducira apoptozu LX-2 stanica. Metoda dvostrukog bojenja s Aneksinom V i 7-AAD korištena je za kvantificiranje stope apoptoze i morfologije stanica protočnom citometrijom. BA stanice inkubirane su s 10 μM, 100 μM i 1 mM IPA tijekom 24 sata ili s F–H TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM IPA u mediju bez seruma tijekom 24 sata. A: žive stanice (Aneksin V -/ 7AAD-); B: nekrotične stanice (Aneksin V -/ 7AAD+); C, F: rane (Aneksin V +/ 7AAD-); D, G: kasne (Aneksin V+/7AAD.+); E, H: postotak ukupnih ranih i kasnih apoptotičkih stanica u stopi apoptoze (%). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD, n = 3 neovisna eksperimenta. Statističke usporedbe provedene su korištenjem jednosmjerne ANOVA s Bonferroni post hoc testom. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Kao što smo prethodno pokazali, 5 ng/ml TGF-β1 može inducirati aktivaciju HSC-a povećanjem ekspresije klasičnih marker gena [15]. LX-2 stanice tretirane su s 5 ng/ml TGF-β1 i 1 mM IPA u kombinaciji (slika 2E–H). Liječenje TGF-β1 nije promijenilo stopu apoptoze, međutim, istodobno liječenje IPA povećalo je kasnu apoptozu i stopu apoptoze (%) u usporedbi s tretmanom TGF-β1 (slika 2E–H). Ovi rezultati ukazuju na to da 1 mM IPA može potaknuti apoptozu u LX-2 stanicama neovisno o indukciji TGF-β1.
Nadalje smo istražili učinak IPA na mitohondrijalno disanje u stanicama LX-2. Rezultati su pokazali da je 1 mM IPA smanjio parametre potrošnje kisika (OCR): nemitohondrijalno disanje, bazalno i maksimalno disanje, curenje protona i proizvodnju ATP-a u usporedbi s kontrolnom skupinom (Slika 3A, B), dok se indeks bioenergetskog zdravlja (BHI) nije promijenio.
IPA smanjuje mitohondrijalno disanje u LX-2 stanicama. Krivulja mitohondrijalnog disanja (OCR) prikazana je kao parametri mitohondrijalnog disanja (nemitohondrijalno disanje, bazalno disanje, maksimalno disanje, istjecanje protona, stvaranje ATP-a, SRC i BHI). Stanice A i B inkubirane su s 10 μM, 100 μM i 1 mM IPA tijekom 24 sata. Stanice C i D inkubirane su s TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM IPA u mediju bez seruma tijekom 24 sata. Sva mjerenja normalizirana su na sadržaj DNA pomoću CyQuant kita. BHI: indeks bioenergetskog zdravlja; SRC: respiratorni rezervni kapacitet; OCR: brzina potrošnje kisika. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD), n = 5 neovisnih eksperimenata. Statističke usporedbe provedene su korištenjem jednosmjerne ANOVA i Bonferronijevog post hoc testa. *p < 0,05; **p < 0,01; i ***p < 0,001
Kako bismo stekli sveobuhvatnije razumijevanje učinka IPA na bioenergetski profil stanica LX-2 aktiviranih TGF-β1, analizirali smo mitohondrijsku oksidativnu fosforilaciju pomoću OCR-a (slika 3C,D). Rezultati su pokazali da tretman TGF-β1 može smanjiti maksimalno disanje, respiratorni rezervni kapacitet (SRC) i BHI u usporedbi s kontrolnom skupinom (slika 3C,D). Osim toga, kombinirani tretman smanjio je bazalno disanje, curenje protona i proizvodnju ATP-a, ali SRC i BHI bili su značajno viši od onih tretiranih s TGF-β1 (slika 3C,D).
Također smo proveli „Test fenotipa stanične energije“ koji pruža Seahorse softver (Dodatna slika 4A–D). Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 3B, metabolički potencijali i OCR-a i ECAR-a smanjeni su nakon tretmana TGF-β1, međutim, nije uočena razlika u skupinama s kombiniranim tretmanom i tretmanom IPA u usporedbi s kontrolnom skupinom. Nadalje, i bazalna i razina stresa OCR-a smanjene su nakon tretmana kombiniranim tretmanom i tretmanom IPA u usporedbi s kontrolnom skupinom (Dodatna slika 4C). Zanimljivo je da je sličan obrazac uočen i s kombiniranom terapijom, gdje nije uočena promjena u bazalnim i razinama stresa ECAR-a u usporedbi s tretmanom TGF-β1 (Dodatna slika 4C). U HSC-ima, smanjenje mitohondrijske oksidativne fosforilacije i sposobnost kombiniranog tretmana da obnovi SCR i BHI nakon izlaganja tretmanu TGF-β1 nisu promijenili metabolički potencijal (OCR i ECAR). Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da IPA može smanjiti bioenergetiku u HSC-ima, što sugerira da IPA može izazvati niži energetski profil koji pomiče fenotip HSC-a prema inaktivaciji (Dodatna slika 4D).
Učinak IPA na dinamiku mitohondrija istražen je trodimenzionalnom kvantifikacijom morfologije mitohondrija i mrežnih veza, kao i MTR bojenjem (Slika 4 i Dopunska slika 5). Slika 4 pokazuje da je, u usporedbi s kontrolnom skupinom, tretman TGF-β1 smanjio prosječnu površinu, broj grana, ukupnu duljinu grana i broj spojeva grana (Slika 4A i B) te promijenio udio mitohondrija od sferne do srednje morfologije (Slika 4C). Samo tretman IPA smanjio je prosječni volumen mitohondrija i promijenio udio mitohondrija od sferne do srednje morfologije u usporedbi s kontrolnom skupinom (Slika 4A). Nasuprot tome, sferičnost, prosječna duljina grana i mitohondrijska aktivnost procijenjena MTR-om ovisnim o potencijalu mitohondrijalne membrane (Slika 4A i E) ostali su nepromijenjeni i ovi se parametri nisu razlikovali između skupina. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da tretman TGF-β1 i IPA moduliraju oblik i veličinu mitohondrija, kao i složenost mreže u živim LX-2 stanicama.
IPA mijenja mitohondrijsku dinamiku i količinu mitohondrijske DNA u LX-2 stanicama. A. Reprezentativne konfokalne slike živih LX-2 stanica inkubiranih s TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM IPA tijekom 24 sata u mediju bez seruma koje prikazuju mitohondrijalne mreže obojene s Mitotracker™ Red CMXRos i jezgre obojene plavo s DAPI. Svi podaci sadržavali su najmanje 15 slika po skupini. Dobili smo 10 Z-stack slika za svaku vrstu uzorka. Svaka sekvenca Z-osi sadržavala je 30 slojeva, svaki debljine 9,86 μm. Mjerilo: 10 μm. B. Reprezentativni objekti (samo mitohondrije) identificirani primjenom adaptivnog određivanja praga na sliku. Kvantitativna analiza i usporedba veza mitohondrijalne morfološke mreže provedene su za sve stanice u svakoj skupini. C. Učestalost omjera oblika mitohondrija. Vrijednosti blizu 0 označavaju sferne oblike, a vrijednosti blizu 1 označavaju nitaste oblike. D Sadržaj mitohondrijalne DNA (mtDNA) određen je kako je opisano u Materijalima i metodama. Analiza E Mitotracker™ Red CMXRos provedena je protočnom citometrijom (30 000 događaja) kako je opisano u odjeljku Materijali i metode. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD, n = 3 neovisna eksperimenta. Statističke usporedbe provedene su korištenjem jednosmjerne ANOVA i Bonferronijevog post hoc testa. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Zatim smo analizirali sadržaj mtDNA u LX-2 stanicama kao pokazatelj broja mitohondrija. U usporedbi s kontrolnom skupinom, sadržaj mtDNA bio je povećan u skupini tretiranoj TGF-β1 (Slika 4D). U usporedbi sa skupinom tretiranom TGF-β1, sadržaj mtDNA bio je smanjen u skupini kombiniranog tretmana (Slika 4D), što sugerira da IPA može smanjiti sadržaj mtDNA i moguće broj mitohondrija, kao i mitohondrijalno disanje (Slika 3C). Štoviše, čini se da IPA smanjuje sadržaj mtDNA u kombiniranom tretmanu, ali nije utjecao na mitohondrijsku aktivnost posredovanu MTR-om (Slike 4A–C).
Istražili smo povezanost IPA s razinama mRNA gena povezanih s fibrozom, apoptozom, preživljavanjem i mitohondrijskom dinamikom u LX-2 stanicama (Slika 5A–D). U usporedbi s kontrolnom skupinom, skupina tretirana TGF-β1 pokazala je povećanu ekspresiju gena kao što su kolagen tipa I α2 lanac (COL1A2), α-glatki mišićni aktin (αSMA), matrična metaloproteinaza 2 (MMP2), tkivni inhibitor metaloproteinaze 1 (TIMP1) i gen sličan dinaminu 1 (DRP1), što ukazuje na povećanu fibrozu i aktivaciju. Nadalje, u usporedbi s kontrolnom skupinom, tretman TGF-β1 smanjio je razine mRNA nuklearnog receptora za pregnan X (PXR), kaspaze 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitora B-stanica α, pojačivača svjetlosnog peptida gena nuklearnog faktora κ (NFκB1A) i inhibitora podjedinice kinaze nuklearnog faktora κB β (IKBKB) (Slika 5A–D). U usporedbi s tretmanom TGF-β1, kombinirani tretman s TGF-β1 i IPA smanjio je ekspresiju COL1A2 i MMP2, ali je povećao razinu mRNA PXR, TIMP1, B-staničnog limfoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β i IKBKB. Tretman IPA značajno je smanjio ekspresiju MMP2, proteina X povezanog s Bcl-2 (BAX), AKT1, proteina optičke atrofije 1 (OPA1) i mitohondrijskog fuzijskog proteina 2 (MFN2), dok je ekspresija CASP8, NFκB1A, NFκB1B i IKBKB bila povećana u usporedbi s kontrolnom skupinom. Međutim, nije pronađena razlika u ekspresiji kaspaze-3 (CASP3), faktora aktivacije apoptotičke peptidaze 1 (APAF1), mitohondrijskog fuzijskog proteina 1 (MFN1) i fisijskog proteina 1 (FIS1). Zajedno, ovi rezultati upućuju na to da tretman IPA modulira ekspresiju gena povezanih s fibrozom, apoptozom, preživljavanjem i mitohondrijskom dinamikom. Naši podaci upućuju na to da tretman IPA smanjuje fibrozu u stanicama LX-2; istovremeno, stimulira preživljavanje pomicanjem fenotipa prema inaktivaciji.
IPA modulira ekspresiju fibroblasta, apoptotičkih, vijabilnih i mitohondrijskih dinamičkih gena u LX-2 stanicama. Histogrami prikazuju ekspresiju mRNA u odnosu na endogenu kontrolu (RPLP0 ili PPIA) nakon što su LX-2 stanice inducirane s TGF-β1 i IPA u mediju bez seruma tijekom 24 sata. A označava fibroblaste, B označava apoptotičke stanice, C označava preživjele stanice, a D označava ekspresiju gena mitohondrijske dinamike. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD), n = 3 neovisna eksperimenta. Statističke usporedbe provedene su korištenjem jednosmjerne ANOVA i Bonferronijevog post hoc testa. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Zatim su promjene u veličini stanica (FSC-H) i citoplazmatskoj složenosti (SSC-H) procijenjene protočnom citometrijom (slika 6A,B), a promjene u morfologiji stanica nakon tretmana IPA procijenjene su transmisijom elektronske mikroskopije (TEM) i faznokontrastnom mikroskopijom (dodatna slika 6A-B). Kao što se i očekivalo, stanice u skupini tretiranoj TGF-β1 povećale su se u usporedbi s kontrolnom skupinom (slika 6A,B), pokazujući klasično širenje hrapavog endoplazmatskog retikuluma (ER*) i fagolizosoma (P), što ukazuje na aktivaciju hematopoetskih matičnih stanica (HSC) (dodatna slika 6A). Međutim, u usporedbi sa skupinom tretiranom TGF-β1, veličina stanica, citoplazmatska složenost (slika 6A,B) i sadržaj ER* smanjeni su u skupini tretiranoj kombinacijom TGF-β1 i IPA (dodatna slika 6A). Nadalje, tretman IPA smanjio je veličinu stanica, citoplazmatsku složenost (slike 6A,B), sadržaj P i ER* (dodatna slika 6A) u usporedbi s kontrolnom skupinom. Osim toga, sadržaj apoptotičkih stanica povećao se nakon 24 sata tretmana IPA u usporedbi s kontrolnom skupinom (bijele strelice, Dodatna slika 6B). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da 1 mM IPA može stimulirati apoptozu HSC-a i poništiti promjene u morfološkim parametrima stanica izazvane TGF-β1, čime se regulira veličina i složenost stanica, što može biti povezano s inaktivacijom HSC-a.
IPA mijenja veličinu stanica i citoplazmatsku složenost u LX-2 stanicama. Reprezentativne slike protočne citometrijske analize. Analiza je koristila strategiju usklađivanja specifičnu za LX-2 stanice: SSC-A/FSC-A za definiranje stanične populacije, FSC-H/FSC-A za identifikaciju dupleta i SSC-H/FSC-H za analizu veličine i složenosti stanica. Stanice su inkubirane s TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM IPA u mediju bez seruma tijekom 24 sata. LX-2 stanice su raspoređene u donji lijevi kvadrant (SSC-H-/FSC-H-), gornji lijevi kvadrant (SSC-H+/FSC-H-), donji desni kvadrant (SSC-H-/FSC-H+) i gornji desni kvadrant (SSC-H+/FSC-H+) za analizu veličine stanica i citoplazmatske složenosti. B. Morfologija stanica analizirana je protočnom citometrijom korištenjem FSC-H (direktno raspršenje, veličina stanica) i SSC-H (bočno raspršenje, citoplazmatska složenost) (30 000 događaja). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD, n = 3 neovisna eksperimenta. Statističke usporedbe provedene su korištenjem jednosmjerne ANOVA i Bonferronijevog post hoc testa. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 i ****p < 0,0001
Metaboliti crijeva poput IPA postali su vruća tema istraživanja, što sugerira da bi se u crijevnoj mikrobioti mogle otkriti nove mete. Stoga je zanimljivo da se IPA, metabolit koji smo povezali s fibrozom jetre kod ljudi [15], pokazao kao potencijalni antifibrotički spoj u životinjskim modelima [13, 14]. Ovdje prvi put pokazujemo povezanost između serumskog IPA-e i globalne transkriptomike jetre te metilacije DNA kod pretilih osoba bez dijabetesa tipa 2 (T2D), ističući apoptozu, mitofagiju i dugovječnost, kao i mogući kandidatski gen AKT1 koji regulira homeostazu jetre. Još jedna novost naše studije je da smo pokazali interakciju liječenja IPA-om s apoptozom, staničnom morfologijom, mitohondrijskom bioenergetikom i dinamikom u LX-2 stanicama, što ukazuje na niži energetski spektar koji pomiče HSC fenotip prema inaktivaciji, čineći IPA potencijalnim kandidatom za poboljšanje fibroze jetre.
Otkrili smo da su apoptoza, mitofagija i dugovječnost najvažniji kanonski putevi obogaćeni genima jetre povezanima s cirkulirajućim serumskim IPA. Poremećaj sustava kontrole kvalitete mitohondrija (MQC) može dovesti do mitohondrijske disfunkcije, mitofagije i apoptoze, čime se potiče pojava MASLD-a [33, 34]. Stoga možemo nagađati da bi IPA mogla biti uključena u održavanje stanične dinamike i integriteta mitohondrija putem apoptoze, mitofagije i dugovječnosti u jetri. Naši podaci pokazali su da su dva gena zajednička u tri testa: YKT6 i AKT1. Vrijedi napomenuti da je YKT6 SNARE protein uključen u proces fuzije stanične membrane. Igra ulogu u autofagiji i mitofagiji stvaranjem inicijacijske kompleksne strukture sa STX17 i SNAP29 na autofagosomu, čime se potiče fuzija autofagosoma i lizosoma [35]. Nadalje, gubitak funkcije YKT6 rezultira oštećenom mitofagijom [36], dok je pojačana regulacija YKT6 povezana s progresijom hepatocelularnog karcinoma (HCC), pokazujući povećano preživljavanje stanica [37]. S druge strane, AKT1 je najvažniji gen koji interagira i igra važnu ulogu u bolestima jetre, uključujući signalni put PI3K/AKT, stanični ciklus, migraciju stanica, proliferaciju, fokalnu adheziju, mitohondrijsku funkciju i lučenje kolagena [38–40]. Aktivirani signalni put PI3K/AKT može aktivirati hematopoetske matične stanice (HSC), koje su stanice odgovorne za proizvodnju izvanstaničnog matriksa (ECM), a njegova disregulacija može doprinijeti pojavi i napredovanju fibroze jetre [40]. Osim toga, AKT je jedan od ključnih čimbenika preživljavanja stanica koji inhibira apoptozu stanica ovisnu o p53, a aktivacija AKT-a može biti povezana s inhibicijom apoptoze stanica jetre [41, 42]. Dobiveni rezultati sugeriraju da bi IPA mogao biti uključen u apoptozu povezanu s mitohondrijima jetre utječući na odluku hepatocita o ulasku u apoptozu ili preživljavanju. Ove učinke mogu regulirati kandidatski geni AKT i/ili YKT6, koji su ključni za homeostazu jetre.
Naši rezultati pokazali su da je 1 mM IPA inducirao apoptozu i smanjio mitohondrijalno disanje u LX-2 stanicama neovisno o tretmanu TGF-β1. Važno je napomenuti da je apoptoza glavni put za rješavanje fibroze i aktivaciju hematopoetskih matičnih stanica (HSC), te je također ključni događaj u reverzibilnom fiziološkom odgovoru na fibrozu jetre [4, 43]. Štoviše, obnova BHI u LX-2 stanicama nakon kombiniranog tretmana pružila je nove uvide u potencijalnu ulogu IPA u regulaciji mitohondrijske bioenergetike. U uvjetima mirovanja i neaktivnosti, hematopoetske stanice normalno koriste mitohondrijalnu oksidativnu fosforilaciju za proizvodnju ATP-a i imaju nisku metaboličku aktivnost. S druge strane, aktivacija HSC pojačava mitohondrijalno disanje i biosintezu kako bi kompenzirala energetske potrebe ulaska u glikolitičko stanje [44]. Činjenica da IPA nije utjecao na metabolički potencijal i ECAR sugerira da je glikolitički put manje prioritetan. Slično tome, druga studija pokazala je da je 1 mM IPA bio u stanju modulirati aktivnost mitohondrijalnog respiratornog lanca u kardiomiocitima, staničnoj liniji ljudskih hepatocita (Huh7) i endotelnim stanicama ljudske pupčane vene (HUVEC); Međutim, nije pronađen učinak IPA na glikolizu u kardiomiocitima, što sugerira da IPA može utjecati na bioenergetiku drugih tipova stanica [45]. Stoga nagađamo da 1 mM IPA može djelovati kao blagi kemijski razdvajač, budući da može značajno smanjiti ekspresiju fibrogenih gena, morfologiju stanica i mitohondrijsku bioenergetiku bez promjene količine mtDNA [46]. Mitohondrijski razdvajači mogu inhibirati fibrozu induciranu kulturom i aktivaciju HSC-a [47] te smanjiti proizvodnju mitohondrijskog ATP-a reguliranu ili induciranu određenim proteinima kao što su proteini za razdvajanje (UCP) ili adenin nukleotid translokaza (ANT). Ovisno o tipu stanice, ovaj fenomen može zaštititi stanice od apoptoze i/ili potaknuti apoptozu [46]. Međutim, potrebna su daljnja istraživanja kako bi se razjasnila uloga IPA kao mitohondrijskog razdvajača u inaktivaciji hematopoetskih matičnih stanica.
Zatim smo istražili odražavaju li se promjene u mitohondrijskom disanju na mitohondrijsku morfologiju u živim LX-2 stanicama. Zanimljivo je da tretman TGF-β1 mijenja mitohondrijski udio od sfernog do srednjeg, sa smanjenim mitohondrijskim grananjem i povećanom ekspresijom DRP1, ključnog čimbenika u mitohondrijskoj fisiji [48]. Nadalje, fragmentacija mitohondrija povezana je s ukupnom složenošću mreže, a prijelaz od fuzije do fisije ključan je za aktivaciju hematopoetskih matičnih stanica (HSC), dok inhibicija mitohondrijske fisije dovodi do apoptoze HSC [49]. Dakle, naši rezultati pokazuju da tretman TGF-β1 može izazvati smanjenje složenosti mitohondrijske mreže sa smanjenim grananjem, što je češće kod mitohondrijske fisije povezane s aktiviranim hematopoetskim matičnim stanicama (HSC). Nadalje, naši podaci pokazali su da IPA može promijeniti udio mitohondrija od sfernog do srednjeg oblika, čime se smanjuje ekspresija OPA1 i MFN2. Studije su pokazale da smanjenje OPA1 može uzrokovati smanjenje potencijala mitohondrijske membrane i pokrenuti apoptozu stanica [50]. Poznato je da MFN2 posreduje u mitohondrijskoj fuziji i apoptozi [51]. Dobiveni rezultati upućuju na to da indukcija LX-2 stanica pomoću TGF-β1 i/ili IPA modulira oblik i veličinu mitohondrija, kao i stanje aktivacije i složenost mreže.
Naši rezultati pokazuju da kombinirani tretman TGFβ-1 i IPA može smanjiti mtDNA i morfološke parametre stanica reguliranjem ekspresije mRNA gena fibroze, apoptoze i gena povezanih s preživljavanjem u stanicama koje izbjegavaju apoptozu. Doista, IPA je smanjio razinu ekspresije mRNA AKT1 i važnih gena fibroze poput COL1A2 i MMP2, ali je povećao razinu ekspresije CASP8, koji je povezan s apoptozom. Naši rezultati pokazali su da se nakon tretmana IPA smanjila ekspresija BAX-a, a povećala ekspresija mRNA podjedinica obitelji TIMP1, BCL-2 i NF-κB, što sugerira da IPA može stimulirati signale preživljavanja u hematopoetskim matičnim stanicama (HSC) koje izbjegavaju apoptozu. Ove molekule mogu djelovati kao pro-preživljavajući signali u aktiviranim hematopoetskim matičnim stanicama, što može biti povezano s povećanom ekspresijom anti-apoptotičkih proteina (kao što je Bcl-2), smanjenom ekspresijom pro-apoptotičkog BAX-a i složenom interakcijom između TIMP-a i NF-κB [5, 7]. IPA ostvaruje svoje učinke putem PXR-a, a otkrili smo da kombinirani tretman s TGF-β1 i IPA povećava razinu ekspresije PXR mRNA, što ukazuje na supresiju aktivacije HSC-a. Poznato je da aktivirana PXR signalizacija inhibira aktivaciju HSC-a i in vivo i in vitro [52, 53]. Naši rezultati pokazuju da IPA može sudjelovati u uklanjanju aktiviranih HSC-a promovirajući apoptozu, smanjujući fibrozu i metabolizam mitohondrija te pojačavajući signale preživljavanja, što su tipični procesi koji pretvaraju aktivirani HSC fenotip u inaktivirani. Drugo moguće objašnjenje potencijalnog mehanizma i uloge IPA-e u apoptozi jest da uklanja disfunkcionalne mitohondrije prvenstveno putem mitofagije (intrinzični put) i ekstrinzičnog TNF signalnog puta (Tablica 1), koji je izravno povezan sa signalnim putem preživljavanja NF-κB (Dodatna slika 7). Zanimljivo je da geni obogaćeni IPA-om mogu inducirati pro-apoptotičke i pro-preživljavajuće signale u apoptotičkom putu [54], što sugerira da IPA može inducirati apoptotički put ili preživljavanje interakcijom s tim genima. Međutim, kako IPA inducira apoptozu ili preživljavanje tijekom aktivacije HSC-a i njegovi mehanistički putevi ostaju nejasni.
IPA je mikrobni metabolit koji nastaje iz prehrambenog triptofana putem crijevne mikrobiote. Studije su pokazale da ima protuupalna, antioksidativna i epigenetička regulatorna svojstva u crijevnom okruženju.[55] Studije su pokazale da IPA može modulirati funkciju crijevne barijere i smanjiti oksidativni stres, što može doprinijeti njegovim lokalnim fiziološkim učincima.[56] Zapravo, IPA se prenosi do ciljnih organa putem cirkulacije, a budući da IPA dijeli sličnu strukturu glavnog metabolita s derivatima triptofana, serotonina i indola, IPA ima metaboličke učinke što rezultira kompetitivnom metaboličkom sudbinom.[52] IPA se može natjecati s metabolitima izvedenim iz triptofana za mjesta vezanja na enzimima ili receptorima, potencijalno remeteći normalne metaboličke putove. To naglašava potrebu za daljnjim istraživanjima njegove farmakokinetike i farmakodinamike kako bi se bolje razumio njegov terapijski prozor.[57] Ostaje za vidjeti može li se to dogoditi i u hematopoetskim matičnim stanicama (HSC).
Priznajemo da naša studija ima neka ograničenja. Kako bismo specifično ispitali povezanost s IPA, isključili smo pacijente s dijabetesom melitusom tipa 2 (DM2). Priznajemo da to ograničava široku primjenjivost naših nalaza na pacijente s dijabetesom melitusom tipa 2 i uznapredovalom bolešću jetre. Iako je fiziološka koncentracija IPA u ljudskom serumu 1–10 μM [11, 20], koncentracija od 1 mM IPA odabrana je na temelju najviše netoksične koncentracije [15] i najviše stope apoptoze, bez razlike u postotku populacije nekrotičnih stanica. Iako su u ovoj studiji korištene suprafiziološke razine IPA, trenutno ne postoji konsenzus o učinkovitoj dozi IPA [52]. Iako su naši rezultati značajni, šira metabolička sudbina IPA ostaje aktivno područje istraživanja. Štoviše, naši nalazi o povezanosti između razine IPA u serumu i metilacije DNA jetrenih transkripata dobiveni su ne samo iz hematopoetskih matičnih stanica (HSC) već i iz tkiva jetre. Odlučili smo koristiti ljudske LX-2 stanice na temelju naših prethodnih nalaza iz analize transkriptoma da je IPA povezana s aktivacijom hematopoetskih matičnih stanica (HSC) [15], a HSC su glavne stanice uključene u progresiju fibroze jetre. Jetra se sastoji od više tipova stanica, stoga bi trebalo razmotriti druge stanične modele poput sustava ko-kulture hepatocita-HSC-imunoloških stanica u kombinaciji s aktivacijom kaspaze i fragmentacijom DNA, kao i mehanizam djelovanja, uključujući razinu proteina, kako bi se proučila uloga IPA i njezina interakcija s drugim tipovima stanica jetre.