Različite teorije obrane biljaka pružaju važne teorijske smjernice za objašnjenje obrazaca metabolizma specijaliziranog za biljke, ali njihova ključna predviđanja tek trebaju biti testirana. Ovdje smo koristili nepristranu tandemsku analizu masene spektrometrije (MS/MS) kako bismo sustavno istražili metabolom atenuiranih sojeva duhana od pojedinačnih biljaka do populacija i blisko srodnih vrsta te obradili veliki broj teorija značajki masene spektrometrije na temelju složenih spektara u informacijama. Okvir za testiranje ključnih predviđanja teorija optimalne obrane (OD) i pokretnih ciljeva (MT). Informacijska komponenta metabolomike biljaka u skladu je s teorijom OD, ali proturječi glavnom predviđanju teorije MT o dinamici metabolomike uzrokovanoj biljojedima. Od mikro do makro evolucijske skale, signal jasmonata identificiran je kao glavna odrednica OD, dok je signal etilena omogućio fino podešavanje odgovora specifičnog za biljojede označenog molekularnom mrežom MS/MS.
Posebni metaboliti s različitim strukturama glavni su sudionici u prilagodbi biljaka okolišu, posebno u obrani od neprijatelja (1). Nevjerojatna raznolikost posebnog metabolizma koji se nalazi u biljkama potaknula je desetljeća dubinskih istraživanja njegovih mnogih aspekata ekoloških funkcija i formirala dugi popis teorija obrane biljaka, koje predstavljaju evolucijski i ekološki razvoj interakcija biljaka i kukaca. Empirijska istraživanja pružaju važne smjernice (2). Međutim, ove teorije obrane biljaka nisu slijedile normativni put hipotetskog deduktivnog zaključivanja, u kojem su ključna predviđanja bila na istoj razini analize (3) i eksperimentalno su testirana kako bi se unaprijedio sljedeći ciklus teorijskog razvoja (4). Tehnička ograničenja ograničavaju prikupljanje podataka na specifične metaboličke kategorije i isključuju sveobuhvatnu analizu specijaliziranih metabolita, čime se sprječavaju međukategorijske usporedbe koje su bitne za teorijski razvoj (5). Nedostatak sveobuhvatnih metabolomskih podataka i zajedničke valute za usporedbu tijeka obrade metaboličkog prostora između različitih biljnih skupina ometa znanstvenu zrelost područja.
Najnoviji razvoj u području metabolomike tandemske masene spektrometrije (MS/MS) može sveobuhvatno karakterizirati metaboličke promjene unutar i između vrsta određenog sistemskog klada, te se može kombinirati s računalnim metodama za izračun strukturne sličnosti između tih složenih smjesa. Prethodno znanje kemije (5). Kombinacija naprednih tehnologija u analizi i računalstvu pruža potreban okvir za dugoročno testiranje mnogih predviđanja ekoloških i evolucijskih teorija metaboličke raznolikosti. Shannon (6) je prvi put uveo teoriju informacija u svom ključnom članku 1948. godine, postavljajući temelje za matematičku analizu informacija, koja se koristi u mnogim područjima osim u svojoj izvornoj primjeni. U genomici se teorija informacija uspješno primjenjuje za kvantificiranje konzervativnih informacija o sekvencama (7). U istraživanjima transkriptomike, teorija informacija analizira ukupne promjene u transkriptomu (8). U prethodnim istraživanjima primijenili smo statistički okvir teorije informacija na metabolomiku kako bismo opisali metaboličku ekspertizu na razini tkiva u biljkama (9). Ovdje kombiniramo MS/MS-bazirani tijek rada sa statističkim okvirom teorije informacija, karakterizirane metaboličkom raznolikošću u zajedničkoj valuti, kako bismo usporedili ključna predviđanja teorije obrane biljaka metaboloma induciranog biljojedima.
Teorijski okviri obrane biljaka obično su međusobno uključivi i mogu se podijeliti u dvije kategorije: one koje pokušavaju objasniti distribuciju metabolita specifičnih za biljke na temelju obrambenih funkcija, kao što su optimalna obrana (OD) (10), teorija pokretne mete (MT) (11) i teorija izgleda (12), dok druge traže mehanička objašnjenja kako promjene u dostupnosti resursa utječu na rast biljaka i akumulaciju specijaliziranih metabolita, kao što su hipoteza o ravnoteži ugljika i hranjivih tvari (13), hipoteza o brzini rasta (14) i hipoteza o ravnoteži rasta i diferencijacije (15). Dva skupa teorija nalaze se na različitim razinama analize (4). Međutim, dvije teorije koje uključuju obrambene funkcije na funkcionalnoj razini dominiraju razgovorom o konstitutivnoj i inducibilnoj obrani biljaka: OD teorija, koja pretpostavlja da biljke ulažu u svoju skupu kemijsku obranu samo kada je to potrebno, na primjer, kada ih proguta. Kada travnata životinja napadne, stoga se, prema mogućnosti budućeg napada, dodjeljuje spoj s obrambenom funkcijom (10); MT hipoteza predlaže da ne postoji os usmjerene promjene metabolita, već se metabolit mijenja nasumično, stvarajući tako mogućnost ometanja metaboličke „mete kretanja“ napadajućih biljojeda. Drugim riječima, ove dvije teorije daju suprotna predviđanja o metaboličkom preoblikovanju koje se događa nakon napada biljojeda: odnos između jednosmjernog nakupljanja metabolita s obrambenom funkcijom (OD) i neusmjerenih metaboličkih promjena (MT) (11).
Hipoteze OD i MT ne uključuju samo inducirane promjene u metabolomu, već i ekološke i evolucijske posljedice akumulacije tih metabolita, poput adaptivnih troškova i koristi tih metaboličkih promjena u specifičnom ekološkom okruženju (16). Iako obje hipoteze prepoznaju obrambenu funkciju specijaliziranih metabolita, koji mogu, ali i ne moraju biti skupi, ključno predviđanje koje razlikuje hipoteze OD i MT leži u usmjerenosti induciranih metaboličkih promjena. Predviđanje teorije OD do sada je dobilo najviše eksperimentalne pažnje. Ovi testovi uključuju proučavanje izravnih ili neizravnih obrambenih funkcija različitih tkiva specifičnih spojeva u staklenicima i prirodnim uvjetima, kao i promjene u fazi razvoja biljaka (17-19). Međutim, do sada, zbog nedostatka tijeka rada i statističkog okvira za globalnu sveobuhvatnu analizu metaboličke raznolikosti bilo kojeg organizma, glavna razlika u predviđanju između dvije teorije (tj. smjer metaboličkih promjena) tek treba biti testirana. Ovdje pružamo takvu analizu.
Jedna od najznačajnijih karakteristika biljno-specifičnih metabolita je njihova ekstremna strukturna raznolikost na svim razinama, od pojedinačnih biljaka, populacija do sličnih vrsta (20). Mnoge kvantitativne promjene u specijaliziranim metabolitima mogu se uočiti na razini populacije, dok se snažne kvalitativne razlike obično održavaju na razini vrste (20). Stoga je metabolička raznolikost biljaka glavni aspekt funkcionalne raznolikosti, što odražava prilagodljivost različitim nišama, posebno onim nišama s različitim mogućnostima invazije posebnih kukaca i uobičajenih biljojeda (21). Od Fraenkelovog (22) revolucionarnog članka o razlozima postojanja biljno-specifičnih metabolita, interakcije s raznim kukcima smatraju se važnim selekcijskim pritiscima, a vjeruje se da su te interakcije oblikovale biljke tijekom evolucije. Metabolički put (23). Međuvrsne razlike u raznolikosti specijaliziranih metabolita mogu također odražavati fiziološku ravnotežu povezanu s konstitutivnom i inducibilnom obranom biljaka od biljojednih strategija, budući da su dvije vrste često negativno korelirane jedna s drugom (24). Iako može biti korisno održavati dobru obranu u svakom trenutku, pravovremene metaboličke promjene povezane s obranom pružaju jasne prednosti jer omogućuju biljkama da alociraju vrijedne resurse u druga fiziološka ulaganja (19, 24) i izbjegnu potrebu za simbiozom. Kolateralna šteta (25). Osim toga, ove reorganizacije specijaliziranih metabolita uzrokovane insektima biljojedima mogu dovesti do destruktivne distribucije u populaciji (26) i mogu odražavati izravna očitanja značajnih prirodnih promjena u signalu jasmonske kiseline (JA), koji se može održati u populaciji. Visoki i niski JA signali su kompromisi između obrane od biljojeda i konkurencije sa specifičnim vrstama (27). Osim toga, specijalizirani biosintetski putevi metabolita će tijekom evolucije brzo gubiti i transformirati se, što će rezultirati neujednačenom metaboličkom distribucijom među blisko srodnim vrstama (28). Ovi polimorfizmi mogu se brzo uspostaviti kao odgovor na promjenjive obrasce biljojeda (29), što znači da je fluktuacija zajednica biljojeda ključni čimbenik koji potiče metaboličku heterogenost.
Ovdje smo konkretno riješili sljedeće probleme. (I) Kako biljojedni kukac rekonfigurira biljni metabolom? (Ii) Koje su glavne informacijske komponente metaboličke plastičnosti koje se mogu kvantificirati kako bi se testirala predviđanja teorije dugoročne obrane? (Iii) Treba li reprogramirati biljni metabolom na način jedinstven za napadača, ako da, kakvu ulogu biljni hormon igra u prilagođavanju specifičnog metaboličkog odgovora i koji metaboliti doprinose specifičnosti obrane vrste? (Iv) Budući da se predviđanja mnogih teorija obrane mogu proširiti na sve razine bioloških tkiva, pitali smo se koliko je konzistentan uzrokovani metabolički odgovor od unutarnje usporedbe do međuvrsne usporedbe? U tu svrhu sustavno smo proučavali metabolom lista nikotina duhana, koji je ekološki modelna biljka s bogatim specijaliziranim metabolizmom, a učinkovit je protiv ličinki dvaju domaćih biljojeda, Lepidoptera Datura (Ms) (vrlo agresivna, uglavnom se jede). Na Solanaceae i Spodoptera littoralis (Sl), pamukovi lisni crvi su svojevrsni "rod", s biljkama domaćinima Solanaceae i drugim domaćinima drugih rodova i porodica koje služe kao biljna hrana. Analizirali smo MS/MS metabolomski spektar i izdvojili statističke deskriptore informacijske teorije kako bismo usporedili OD i MT teorije. Izradili smo karte specifičnosti kako bismo otkrili identitet ključnih metabolita. Analiza je proširena na domaću populaciju N. nasi i blisko srodnih vrsta duhana kako bismo dalje analizirali kovarijancu između signalizacije biljnih hormona i indukcije OD.
Kako bismo dobili cjelokupnu kartu plastičnosti i strukture metaboloma lista biljojednog duhana, koristili smo prethodno razvijeni tijek rada za analizu i izračun kako bismo sveobuhvatno prikupili i dekonvoluirali MS/MS spektre visoke rezolucije neovisne o podacima iz biljnih ekstrakata (9). Ova nediferencirana metoda (nazvana MS/MS) može konstruirati neredundantne spektre spojeva, koji se zatim mogu koristiti za sve ovdje opisane analize na razini spojeva. Ovi dekonvoluirani biljni metaboliti su različitih vrsta, a sastoje se od stotina do tisuća metabolita (ovdje oko 500-1000 s/MS/MS). Ovdje razmatramo metaboličku plastičnost u okviru teorije informacija i kvantificiramo raznolikost i profesionalnost metaboloma na temelju Shannonove entropije raspodjele metaboličke frekvencije. Koristeći prethodno implementiranu formulu (8), izračunali smo skup pokazatelja koji se mogu koristiti za kvantificiranje raznolikosti metaboloma (Hj pokazatelj), specijalizacije metaboličkog profila (δj pokazatelj) i metaboličke specifičnosti jednog metabolita (Si pokazatelj). Osim toga, primijenili smo indeks plastičnosti relativne udaljenosti (RDPI) kako bismo kvantificirali inducibilnost metaboloma biljojeda (slika 1A) (30). Unutar ovog statističkog okvira, MS/MS spektar tretiramo kao osnovnu informacijsku jedinicu i obrađujemo relativnu brojnost MS/MS u kartu distribucije frekvencija, a zatim koristimo Shannonovu entropiju za procjenu raznolikosti metaboloma iz njega. Specijalizacija metaboloma mjeri se prosječnom specifičnošću jednog MS/MS spektra. Stoga se povećanje brojnosti nekih MS/MS klasa nakon indukcije biljojeda transformira u spektralnu inducibilnost, RDPI i specijalizaciju, odnosno povećanje δj indeksa, jer se proizvode specijaliziraniji metaboliti i proizvodi se visoki Si indeks. Snižavanje Hj indeksa raznolikosti odražava da se ili smanjuje broj generiranih MS/MS ili se raspodjela frekvencija profila mijenja u manje ujednačenom smjeru, uz smanjenje njezine ukupne nesigurnosti. Izračunom Si indeksa moguće je istaknuti koje MS/MS induciraju određeni biljojedi, a naprotiv, koji MS/MS ne reagiraju na indukciju, što je ključni pokazatelj za razlikovanje MT i OD predviđanja.
(A) Statistički deskriptori korišteni za inducibilnost podataka (RDPI) MS/MS podataka biljojeda (H1 do Hx), raznolikost (Hj indeks), specijalizaciju (δj indeks) i specifičnost metabolita (Si indeks). Povećanje stupnja specijalizacije (δj) ukazuje na to da će se u prosjeku proizvoditi više metabolita specifičnih za biljojede, dok smanjenje raznolikosti (Hj) ukazuje na smanjenje proizvodnje metabolita ili neravnomjernu raspodjelu metabolita na karti distribucije. Vrijednost Si procjenjuje je li metabolit specifičan za određeno stanje (ovdje, biljojed) ili se obrnuto održava na istoj razini. (B) Konceptualni dijagram predviđanja teorije obrane korištenjem osi teorije informacija. Teorija OD predviđa da će napad biljojeda povećati obrambene metabolite, čime se povećava δj. Istovremeno, Hj se smanjuje jer se profil reorganizira prema smanjenoj nesigurnosti metaboličkih informacija. Teorija MT predviđa da će napad biljojeda uzrokovati neusmjerene promjene u metabolomu, čime se povećava Hj kao pokazatelj povećane nesigurnosti metaboličkih informacija i uzrokuje slučajnu raspodjelu Si. Također smo predložili mješoviti model, najbolji MT, u kojem će neki metaboliti s višim obrambenim vrijednostima biti posebno povećani (visoka vrijednost Si), dok će drugi pokazivati ​​nasumične odgovore (niža vrijednost Si).
Koristeći deskriptore teorije informacija, interpretiramo OD teoriju kako bismo predvidjeli da će promjene posebnih metabolita izazvane biljojedima u neinduciranom konstitutivnom stanju dovesti do (i) povećanja metaboličke specifičnosti (Si indeks) što potiče metabonomsku specifičnost (δj indeks) (povećanje) određenih skupina posebnih metabolita s većom obrambenom vrijednošću i (ii) smanjenja raznolikosti metaboloma (Hj indeks) zbog promjene raspodjele metaboličke frekvencije prema većoj raspodjeli leptinskih tijela. Na razini pojedinačnog metabolita očekuje se uređena raspodjela Si, gdje će metabolit povećati vrijednost Si u skladu sa svojom obrambenom vrijednošću (Slika 1B). U tom smislu, objašnjavamo MT teoriju kako bismo predvidjeli da će pobuđivanje dovesti do (i) neusmjerenih promjena u metabolitima što će rezultirati smanjenjem δj indeksa i (ii) povećanja Hj indeksa zbog povećanja metaboličke nesigurnosti ili slučajnosti, koja se može kvantificirati Shannonovom entropijom u obliku generalizirane raznolikosti. Što se tiče metaboličkog sastava, MT teorija će predvidjeti slučajnu raspodjelu Si. Uzimajući u obzir da se određeni metaboliti nalaze pod specifičnim uvjetima, a drugi uvjeti nisu pod specifičnim uvjetima, te da njihova obrambena vrijednost ovisi o okolini, predložili smo i model mješovite obrane u kojem su δj i Hj raspoređeni u dva smjera duž Si. S porastom u svim smjerovima, samo će određene skupine metabolita, koje imaju veće obrambene vrijednosti, posebno povećati Si, dok će drugi imati slučajnu raspodjelu (Slika 1B).
Kako bismo testirali predviđanje redefinirane teorije obrane na osi deskriptora teorije informacija, podigli smo ličinke biljojeda stručnjaka (Ms) ili generalista (Sl) na listovima Nepenthes pallens (Slika 2A). Korištenjem MS/MS analize, dobili smo 599 neredundantnih MS/MS spektara (datoteka podataka S1) iz metanolnih ekstrakata tkiva lista prikupljenih nakon hranjenja gusjenica. Korištenje RDPI, Hj i δj indeksa za vizualizaciju rekonfiguracije informacijskog sadržaja u MS/MS konfiguracijskim datotekama otkriva zanimljive obrasce (Slika 2B). Opći trend je da, kako je opisano informacijskim deskriptorom, kako gusjenice nastavljaju jesti lišće, stupanj sve metaboličke reorganizacije raste s vremenom: 72 sata nakon što biljojed jede, RDPI se značajno povećava. U usporedbi s neoštećenom kontrolom, Hj je značajno smanjen, što je bilo zbog povećanog stupnja specijalizacije metaboličkog profila, koji je kvantificiran indeksom δj. Ovaj očiti trend u skladu je s predviđanjima OD teorije, ali nije u skladu s glavnim predviđanjima MT teorije, koja vjeruje da se slučajne (neusmjerene) promjene u razinama metabolita koriste kao obrambena kamuflaža (Slika 1B). Iako se sadržaj elicitora oralne sekrecije (OS) i ponašanje hranjenja ova dva biljojeda razlikuju, njihovo izravno hranjenje rezultiralo je sličnim promjenama u smjerovima Hj i δj tijekom 24-satnog i 72-satnog razdoblja žetve. Jedina razlika dogodila se nakon 72 sata RDPI-ja. U usporedbi s onim uzrokovanim hranjenjem Ms, ukupni metabolizam induciran hranjenjem Sl bio je veći.
(A) Eksperimentalni dizajn: biljojedi obične svinje (S1) ili stručnjakinje (Ms) hrane se desaliniziranim lišćem biljaka vrčeva, dok se za simulirani biljojed koristi OS Ms (W + OSMs) za rukovanje ubodom rane na standardiziranim položajima lista. Ličinke S1 (W + OSSl) ili voda (W + W). Kontrola (C) je neoštećeni list. (B) Indeks inducibilnosti (RDPI u usporedbi s kontrolnom kartom), raznolikosti (Hj indeks) i specijalizacije (δj indeks) izračunat za kartu posebnih metabolita (599 MS/MS; datoteka S1). Zvjezdice označavaju značajne razlike između izravnog hranjenja biljojeda i kontrolne skupine (Studentov t-test s parnim t-testom, *P<0,05 i ***P<0,001). ns, nije važno. (C) Indeks vremenske rezolucije glavnog (plavi okvir, aminokiselina, organska kiselina i šećer; datoteka S2) i spektra posebnih metabolita (crveni okvir 443 MS/MS; datoteka S1) nakon simuliranog tretmana biljojeda. Traka u boji odnosi se na 95% interval pouzdanosti. Zvjezdica označava značajnu razliku između tretmana i kontrole [kvadratna analiza varijance (ANOVA), nakon čega slijedi Tukeyjeva iskreno značajna razlika (HSD) za post hoc višestruke usporedbe, *P<0,05, **P<0,01 i *** P <0,001]. (D) Specijalizacija dijagrama raspršenja i profila posebnih metabolita (ponovljeni uzorci s različitim tretmanima).
Kako bismo istražili odražava li se preoblikovanje izazvano biljojedima na razini metaboloma u promjenama u razini pojedinačnih metabolita, prvo smo se usredotočili na metabolite prethodno proučavane u listovima Nepenthes pallens s dokazanom otpornošću na biljojede. Fenolni amidi su konjugati hidroksicinamamid-poliamina koji se nakupljaju tijekom biljojedskog procesa insekata i poznato je da smanjuju učinkovitost insekata (32). Pretražili smo prekursore odgovarajućeg MS/MS i nacrtali njihove kumulativne kinetičke krivulje (slika S1). Nije iznenađujuće da su derivati ​​fenola koji nisu izravno uključeni u obranu od biljojeda, poput klorogene kiseline (CGA) i rutina, smanjeni nakon biljojeda. Nasuprot tome, biljojedi mogu učiniti fenol amide vrlo potentnima. Kontinuirano hranjenje dvaju biljojeda rezultiralo je gotovo istim spektrom pobude fenolamida, a taj je obrazac bio posebno očit za de novo sintezu fenolamida. Isti fenomen će se uočiti pri istraživanju puta 17-hidroksigeranil nonandiol diterpenskih glikozida (17-HGL-DTG), koji proizvodi veliki broj acikličkih diterpena s učinkovitim anti-biljojedskim funkcijama (33), od kojih je hranjenje s Sl izazvalo sličan profil ekspresije (slika S1).
Mogući nedostatak eksperimenata s izravnim hranjenjem biljojeda je razlika u brzini konzumacije lišća i vremenu hranjenja biljojeda, što otežava uklanjanje specifičnih učinaka biljojeda uzrokovanih ranama i biljojedima. Kako bismo bolje riješili specifičnost induciranog metaboličkog odgovora lista kod biljojeda, simulirali smo hranjenje ličinki Ms i Sl odmah primjenom svježe prikupljenog OS (OSM i OSS1) na standardnu ​​punkciju W konzistentnih položaja lista. Ovaj postupak naziva se W + OS tretman i standardizira indukciju preciznim određivanjem vremena početka odgovora koji izaziva biljojed, a da pritom ne uzrokuje zbunjujuće učinke razlika u brzini ili količini gubitka tkiva (Slika 2A) (34). Koristeći MS/MS analizu i proračunski cjevovod, dobili smo 443 MS/MS spektra (datoteka podataka S1), koji su se preklapali sa spektrima prethodno sastavljenim iz eksperimenata s izravnim hranjenjem. Analiza informacijske teorije ovog MS/MS skupa podataka pokazala je da reprogramiranje metaboloma specijaliziranih za list simuliranjem biljojeda pokazuje specifične OS poticaje (Slika 2C). Posebno, u usporedbi s tretmanom OSS1, OSM je uzrokovao pojačanje specijalizacije metaboloma nakon 4 sata. Vrijedi napomenuti da je, u usporedbi s eksperimentalnim skupom podataka o izravnom hranjenju biljojeda, metabolička kinetika vizualizirana u dvodimenzionalnom prostoru korištenjem Hj i δj kao koordinata i usmjerenost specijalizacije metaboloma kao odgovor na simulirani tretman biljojeda tijekom vremena konzistentno rasla (Slika 2D). Istovremeno, kvantificirali smo sadržaj aminokiselina, organskih kiselina i šećera (datoteka podataka S2) kako bismo istražili je li ovo ciljano povećanje stručnosti metaboloma posljedica rekonfiguracije središnjeg metabolizma ugljika kao odgovor na simulirane biljojede (Slika S2). Kako bismo bolje objasnili ovaj obrazac, dodatno smo pratili kinetiku metaboličke akumulacije prethodno raspravljenih puteva fenolamida i 17-HGL-DTG. Indukcija biljojeda specifična za OS transformira se u diferencijalni obrazac preuređenja unutar metabolizma fenolamida (Slika S3). Fenolni amidi koji sadrže kumarinske i kafeoilne dijelove preferencijalno se induciraju pomoću OSS1, dok OSM-ovi pokreću specifičnu indukciju ferulil konjugata. Za 17-HGL-DTG put, detektirana je diferencijalna indukcija OS-a nizvodnim produktima malonilacije i dimalonilacije (slika S3).
Zatim smo proučavali plastičnost transkriptoma induciranu OS-om koristeći skup podataka mikročipova s ​​vremenskim tijekom, koji simulira upotrebu OSM-ova za tretiranje listova biljke rozete kod biljojeda. Kinetika uzorkovanja u osnovi se preklapa s kinetikom korištenom u ovoj studiji metabolomike (35). U usporedbi s rekonfiguracijom metaboloma u kojoj se metabolička plastičnost posebno povećava tijekom vremena, opažamo prolazne transkripcijske nalete u listovima inducirane Ms, gdje su inducibilnost transkriptoma (RDPI) i specijalizacija (δj) na 1. Došlo je do značajnog povećanja sati i raznolikosti (Hj) u ovom vremenskom trenutku, ekspresija BMP1 je značajno smanjena, nakon čega slijedi opuštanje specijalizacije transkriptoma (Slika S4). Obitelji metaboličkih gena (kao što su P450, glikoziltransferaza i BAHD aciltransferaza) sudjeluju u procesu sastavljanja posebnih metabolita iz strukturnih jedinica izvedenih iz primarnog metabolizma, slijedeći spomenuti rani model visoke specijalizacije. Kao studija slučaja, analiziran je put fenilalanina. Analiza je potvrdila da su ključni geni u metabolizmu fenolamida visoko OS-inducirani kod biljojeda u usporedbi s neprivučenim biljkama te su blisko usklađeni u svojim obrascima ekspresije. Transkripcijski faktor MYB8 i strukturni geni PAL1, PAL2, C4H i 4CL uzvodno od ovog puta pokazali su ranu inicijaciju transkripcije. Aciltransferaze koje igraju ulogu u konačnom sastavljanju fenolamida, poput AT1, DH29 i CV86, pokazuju produljeni obrazac pojačane regulacije (slika S4). Gornja zapažanja ukazuju na to da su rana inicijacija specijalizacije transkriptoma i kasnije pojačanje metabolomske specijalizacije povezani način rada, što može biti posljedica sinkronog regulatornog sustava koji pokreće snažan obrambeni odgovor.
Rekonfiguracija u signalizaciji biljnih hormona djeluje kao regulatorni sloj koji integrira informacije biljojeda kako bi reprogramirao fiziologiju biljaka. Nakon simulacije biljojeda, izmjerili smo kumulativnu dinamiku ključnih kategorija biljnih hormona i vizualizirali vremensku koekspresiju između njih [Pearsonov koeficijent korelacije (PCC) > 0,4] (Slika 3A). Kao što se i očekivalo, biljni hormoni povezani s biosintezom povezani su unutar mreže koekspresije biljnih hormona. Osim toga, metabolička specifičnost (Si indeks) mapirana je na ovu mrežu kako bi se istaknuli biljni hormoni inducirani različitim tretmanima. Nacrtana su dva glavna područja specifičnog odgovora biljojeda: jedno je u JA klasteru, gdje JA (njegov biološki aktivni oblik JA-Ile) i drugi JA derivati ​​pokazuju najviši Si rezultat; drugo je etilen (ET). Giberelin je pokazao samo umjereno povećanje specifičnosti biljojeda, dok su drugi biljni hormoni, poput citokinina, auksina i abscisinske kiseline, imali nisku specifičnost indukcije za biljojede. U usporedbi s korištenjem samo W + W, pojačanje vršne vrijednosti JA derivata putem primjene OS (W + OS) može se u osnovi transformirati u snažan specifični indikator JA. Neočekivano, poznato je da OSM i OSS1 s različitim sadržajem elicitora uzrokuju sličnu akumulaciju JA i JA-Ile. Za razliku od OSS1, OSM je specifično i snažno induciran OSM-ovima, dok OSS1 ne pojačava odgovor bazalnih rana (Slika 3B).
(A) Analiza mreže koekspresije temeljena na PCC izračunu simulacije kinetike akumulacije biljnih hormona induciranih biljojedima. Čvor predstavlja jedan biljni hormon, a veličina čvora predstavlja Si indeks specifičan za biljni hormon između tretmana. (B) Akumulacija JA, JA-Ile i ET u listovima uzrokovana različitim tretmanima označena je različitim bojama: marelica, W + OSM; plava, W + OSSl; crna, W + W; siva, C (kontrola). Zvjezdice označavaju značajne razlike između tretmana i kontrole (dvosmjerna ANOVA nakon koje slijedi Tukey HSD post hoc višestruka usporedba, *** P <0,001). Analiza informacijske teorije (C)697 MS/MS (datoteka podataka S1) u biosintezi JA i spektru oštećene percepcije (irAOC i irCOI1) i (D)585 MS/MS (datoteka podataka S1) u ETR1 s oštećenim ET signalom. Dva simulirana tretmana biljojeda aktivirala su linije biljaka i kontrolne biljke s praznim vozilom (EV). Zvjezdice označavaju značajne razlike između tretmana W+OS i neoštećene kontrole (dvosmjerna ANOVA nakon koje slijedi Tukey HSD post hoc višestruka usporedba, *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001). (E) Raspršeni grafovi raspršenog protivljenja specijalizaciji. Boje predstavljaju različite genetski modificirane sojeve; simboli predstavljaju različite metode tretmana: trokut, W + OSS1; pravokutnik, W + OSM; krug C
Zatim koristimo genetski modificirani soj atenuiranih Nepenthesa (irCOI1 i sETR1) u ključnim koracima biosinteze JA i ET (irAOC i irACO) i percepcije (irCOI1 i sETR1) kako bismo analizirali metabolizam ova dva biljna hormona na biljojede. Relativni doprinos reprogramiranja. U skladu s prethodnim eksperimentima, potvrdili smo indukciju biljojed-OS u biljkama s praznim nosačima (EV) (Slika 3, C do D) i ukupno smanjenje Hj indeksa uzrokovano OSM-om, dok se δj indeks povećao. Odgovor je izraženiji od odgovora potaknutog OSS1. Dvolinijski grafikon koji koristi Hj i δj kao koordinate pokazuje specifičnu deregulaciju (Slika 3E). Najočitiji trend je da su kod sojeva kojima nedostaje JA signal, raznolikost metaboloma i promjene specijalizacije uzrokovane biljojedima gotovo u potpunosti eliminirane (Slika 3C). Nasuprot tome, tiha percepcija ET-a kod sETR1 biljaka, iako je ukupni učinak na promjene u metabolizmu biljojeda mnogo niži od učinka JA signalizacije, smanjuje razliku u Hj i δj indeksima između OSM i OSS1 pobuda (Slika 3D i Slika S5). To ukazuje na to da osim osnovne funkcije transdukcije JA signala, transdukcija ET signala služi i kao fino podešavanje specifičnog metaboličkog odgovora biljojeda. U skladu s ovom funkcijom finog podešavanja, nije bilo promjene u ukupnoj inducibilnosti metaboloma kod sETR1 biljaka. S druge strane, u usporedbi s sETR1 biljkama, irACO biljke inducirale su slične ukupne amplitude metaboličkih promjena uzrokovanih biljojedima, ali su pokazale značajno različite Hj i δj rezultate između OSM i OSS1 izazova (Slika S5).
Kako bismo identificirali specijalizirane metabolite koji imaju važan doprinos specifičnom odgovoru biljojeda i fino podesili njihovu proizvodnju putem ET signala, koristili smo prethodno razvijenu strukturnu MS/MS metodu. Ova metoda se oslanja na metodu bi-klasteriranja kako bi se ponovno zaključila metabolička porodica iz MS/MS fragmenata [normalizirani skalarni produkt (NDP)] i rezultata sličnosti na temelju neutralnog gubitka (NL). Skup podataka MS/MS konstruiran analizom ET transgenih linija proizveo je 585 MS/MS (datoteka podataka S1), što je razlučeno njihovim grupiranjem u sedam glavnih MS/MS modula (M) (Slika 4A). Neki od ovih modula gusto su pakirani s prethodno karakteriziranim posebnim metabolitima: na primjer, M1, M2, M3, M4 i M7 bogati su raznim derivatima fenola (M1), flavonoidnim glikozidima (M2), acilnim šećerima (M3 i M4) i 17-HGL-DTG (M7). Osim toga, izračunavaju se metabolički specifične informacije (Si indeks) pojedinog metabolita u svakom modulu, a njegova Si distribucija može se intuitivno vidjeti. Ukratko, MS/MS spektri koji pokazuju visoku specifičnost za herbivornost i genotip karakterizirani su visokim vrijednostima Si, a statistika kurtoze ukazuje na distribuciju krzna na desnom kutu repa. Jedna takva mršava koloidna distribucija otkrivena je u M1, u kojem je fenol amid pokazao najveći udio Si (Slika 4B). Prethodno spomenuti herbivorni inducibilni 17-HGL-DTG u M7 pokazao je umjereni Si rezultat, što ukazuje na umjereni stupanj diferencijalne regulacije između dva tipa OS. Nasuprot tome, većina konstitutivno proizvedenih specijaliziranih metabolita, poput rutina, CGA i acil šećera, među je najnižim Si rezultatima. Kako bi se bolje istražila strukturna složenost i distribucija Si između posebnih metabolita, konstruirana je molekularna mreža za svaki modul (Slika 4B). Važno predviđanje OD teorije (sažeto na slici 1B) jest da bi reorganizacija posebnih metabolita nakon biljojeda trebala dovesti do jednosmjernih promjena u metabolitima s visokom obrambenom vrijednošću, posebno povećanjem njihove specifičnosti (za razliku od slučajne distribucije) Način) Obrambeni metabolit predviđen MT teorijom. Većina fenolnih derivata akumuliranih u M1 funkcionalno je povezana s padom učinkovitosti insekata (32). Uspoređujući vrijednosti Si u M1 metabolitima između induciranih listova i sastavnih listova kontrolnih EV biljaka nakon 24 sata, primijetili smo da metabolička specifičnost mnogih metabolita nakon biljojeda ima značajan trend porasta (slika 4C). Specifično povećanje vrijednosti Si otkriveno je samo u obrambenim fenolamidima, ali nije otkriveno povećanje vrijednosti Si u drugim fenolima i nepoznatim metabolitima koji koegzistiraju u ovom modulu. Ovo je specijalizirani model koji je povezan s OD teorijom. Glavna predviđanja metaboličkih promjena uzrokovanih biljojedima su konzistentna. Kako bismo testirali je li ova posebnost fenolamidnog spektra inducirana OS-specifičnim ET-om, nacrtali smo indeks metabolita Si i uzrokovali diferencijalnu vrijednost ekspresije između OSM i OSS1 u genotipovima EV i sETR1 (Slika 4D). U sETR1, razlika izazvana fenamidom između OSM i OSS1 bila je znatno smanjena. Metoda bi-klasteriranja također je primijenjena na MS/MS podatke prikupljene u sojevima s nedovoljnim JA kako bi se zaključili glavni MS/MS moduli povezani s JA-reguliranom metaboličkom specijalizacijom (Slika S6).
(A) Rezultati grupiranja 585 MS/MS na temelju zajedničkih fragmenata (sličnost NDP-a) i zajedničkih neutralnih gubitaka (sličnost NL-a) rezultiraju modulom (M) koji je konzistentan s poznatom obitelji spojeva ili nepoznatim ili slabo metaboliziranim sastavom metabolita. Pored svakog modula prikazana je specifična (Si) distribucija metabolita (MS/MS). (B) Modularna molekularna mreža: Čvorovi predstavljaju MS/MS i rubove, NDP (crveno) i NL (plavo) MS/MS rezultate (granica, > 0,6). Indeks specifičnosti graduiranog metabolita (Si) obojen je na temelju modula (lijevo) i mapiran na molekularnu mrežu (desno). (C) Modul M1 EV biljke u konstitutivnom (kontrola) i induciranom stanju (simulirani biljojed) nakon 24 sata: dijagram molekularne mreže (vrijednost Si je veličina čvora, obrambeni fenolamid je označen plavom bojom). (D) Dijagram molekularne mreže M1 spektralne linije sETR1 s oštećenom EV i ET percepcijom: fenolni spoj predstavljen zelenim kružnim čvorom i značajna razlika (P vrijednost) između tretmana W + OSM i W + OSS1 kao veličina čvora. CP, N-kafeoil-tirozin; CS, N-kafeoil-spermidin; FP, ester N-ferulinske kiseline-urinska kiselina; FS, N-ferulil-spermidin; CoP, N', N “-kumarolil-tirozin; DCS, N', N”-dikafeoil-spermidin; CFS, N', N”-kafeoil, feruloil-spermidin; Lycium barbarum u vučjoj bobici Son; Nick. O-AS, O-acil šećer.
Analizu smo proširili s jednog atenuiranog genotipa Nepenthes na prirodne populacije, gdje su prethodno opisane snažne intraspecifične promjene u razinama JA biljojeda i specifičnim razinama metabolita u prirodnim populacijama (26). Koristite ovaj skup podataka za pokrivanje 43 germplazme. Ove germplazme sastoje se od 123 vrste biljaka iz N. pallens. Ove biljke su preuzete iz sjemena prikupljenih u različitim autohtonim staništima u Utahu, Nevadi, Arizoni i Kaliforniji (slika S7), izračunali smo raznolikost metaboloma (ovdje nazvanu razina populacije) β raznolikost) i specijalizaciju uzrokovanu OSM-om. U skladu s prethodnim studijama, uočili smo širok raspon metaboličkih promjena duž osi Hj i δj, što ukazuje na to da germplazme imaju značajne razlike u plastičnosti svojih metaboličkih odgovora na biljojede (slika S7). Ova organizacija podsjeća na prethodna zapažanja o dinamičkom rasponu promjena JA uzrokovanih biljojedima i održala je vrlo visoku vrijednost u jednoj populaciji (26, 36). Korištenjem JA i JA-Ile za testiranje ukupne korelacije razine između Hj i δj, otkrili smo da postoji značajna pozitivna korelacija između JA i raznolikosti i indeksa specijalizacije metaboloma β (slika S7). To sugerira da bi heterogenost u indukciji JA uzrokovana biljojedima, otkrivena na razini populacije, mogla biti posljedica ključnih metaboličkih polimorfizama uzrokovanih selekcijom insekata biljojeda.
Prethodne studije pokazale su da se vrste duhana uvelike razlikuju po vrsti i relativnoj ovisnosti o induciranoj i konstitutivnoj metaboličkoj obrani. Vjeruje se da su te promjene u prijenosu signala protiv biljojeda i obrambenim sposobnostima regulirane pritiskom populacije kukaca, životnim ciklusom biljke i troškovima obrambene proizvodnje u niši u kojoj određena vrsta raste. Proučavali smo dosljednost preoblikovanja metaboloma lista izazvanog biljojedima šest vrsta Nicotiana porijeklom iz Sjeverne i Južne Amerike. Ove vrste su usko povezane s Nepenthes North America, naime Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. atenuated grass, Nicotiana tabacum, linearni duhan, duhan (Nicotiana spegazzinii) i duhan iz lista duhana (Nicotiana obtusifolia) (Slika 5A) (37). Šest ovih vrsta, uključujući dobro karakteriziranu vrstu N. please, jednogodišnje su biljke klade petunia, a obtusifolia N. su trajnice sestrinske klade Trigonophyllae (38). Nakon toga, indukcija W + W, W + OSM i W + OSS1 provedena je na ovih sedam vrsta kako bi se proučilo metaboličko preuređenje hranjenja kukaca na razini vrste.
(A) Filogenetsko stablo "bootstrap" na temelju maksimalne vjerojatnosti [za sintezu nuklearnog glutamina (38)] i geografske rasprostranjenosti sedam blisko srodnih vrsta Nicotiana (različite boje) (37). (B) Dijagram raspršenja specijalizirane raznolikosti za metaboličke profile sedam vrsta Nicotiana (939 MS/MS; datoteka S1). Na razini vrste, raznolikost metaboloma negativno je korelirana sa stupnjem specijalizacije. Analiza korelacije na razini vrste između metaboličke raznolikosti i specijalizacije te akumulacije JA prikazana je na slici 2. S9. Boja, različite vrste; trokut, W + OSS1; pravokutnik, W + OSM; (C) Dinamika JA i JA-Ile Nicotiana rangirana je prema amplitudi pobuđivanja OS-a (dvosmjerna ANOVA i Tukey HSD nakon višestruke usporedbe, * P <0,05, ** P <0,01 i * ** Za usporedbu W + OS i W + W, P <0,001). Okvirni dijagram (D) raznolikosti i (E) specijalizacije svake vrste nakon simuliranja biljojeda i metil JA (MeJA). Zvjezdica označava značajnu razliku između W + OS i W + W ili lanolina plus W (Lan + W) ili Lan plus MeJA (Lan + MeJa) i Lan kontrole (dvosmjerna analiza varijance, nakon čega slijedi Tukeyjeva HSD post hoc višestruka usporedba, *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001).
Korištenjem metode dvostrukih klastera identificirali smo 9 modula od 939 MS/MS (datoteka s podacima S1). Sastav MS/MS rekonfiguriranih različitim tretmanima uvelike varira među različitim modulima između vrsta (Slika S8). Vizualizacija Hj (ovdje se naziva γ-raznolikost na razini vrste) i δj otkriva da se različite vrste agregiraju u vrlo različite skupine u metaboličkom prostoru, gdje je podjela na razini vrste obično izraženija od ekscitacije. S izuzetkom N. linear i N. obliquus, one pokazuju širok dinamički raspon indukcijskih učinaka (Slika 5B). Nasuprot tome, vrste poput N. purpurea i N. obtusifolia imaju manje očigledan metabolički odgovor na tretman, ali je metabolom raznolikiji. Raspodjela induciranog metaboličkog odgovora specifična za vrstu rezultirala je značajnom negativnom korelacijom između specijalizacije i gama raznolikosti (PCC = -0,46, P = 4,9 × 10-8). Promjene u razinama JA izazvane OS-om pozitivno su korelirane sa specijalizacijom metaboloma i negativno su korelirane s metaboličkom gama raznolikošću koju pokazuje svaka vrsta (Slika 5B i Slika S9). Vrijedi napomenuti da su vrste kolokvijalno nazvane vrstama "odgovora na signal" na Slici 5C, kao što su Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute i Nepenthes attenuated, uzrokovale značajne znakove nakon 30 minuta. Nedavne OS-specifične epidemije JA i JA-Ile, dok druge bakterije nazvane "neodgovorne na signal", poput Nepenthes mills, Nepenthes powdery i N. obtusifolia, pokazuju samo indukciju JA-Ile Edge bez ikakve specifičnosti za OS (Slika 5C). Na metaboličkoj razini, kao što je gore spomenuto, za atenuirane Nepenthes, tvari koje reagiraju na signal pokazale su specifičnost za OS i značajno povećale δj, dok su smanjile Hj. Ovaj OS-specifičan učinak početnog djelovanja nije otkriven kod vrsta klasificiranih kao vrste koje ne reagiraju na signal (Slika 5, D i E). Metaboliti specifični za OS češće se dijele između vrsta koje reagiraju na signal, a ti signalni klasteri se grupiraju s vrstama sa slabijim signalnim odgovorima, dok vrste sa slabijim signalnim odgovorima pokazuju manju međuovisnost (slika S8). Ovaj rezultat ukazuje na to da su indukcija JA-ova specifična za OS i rekonfiguracija nizvodnog metaboloma specifična za OS povezane na razini vrste.
Zatim smo koristili lanolin pastu koja sadrži metil JA (MeJA) za tretiranje biljaka kako bismo istražili jesu li ti načini spajanja ograničeni dostupnošću JA primijenjenog egzogenim JA, koji će biti u citoplazmi biljaka. Brza deesterifikacija je JA. Otkrili smo isti trend postupne promjene od vrsta koje reagiraju na signal do vrsta koje ne reagiraju na signal, uzrokovan kontinuiranom opskrbom JA (Slika 5, D i E). Ukratko, tretman MeJA snažno je reprogramirao metabolome linearnih nematoda, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens i N. mikimotoi, što je rezultiralo značajnim povećanjem δj i smanjenjem Hj. Samo je N. purpurea pokazala povećanje δj, ali ne i Hj. N. obtusifolia, za koju je prethodno pokazano da akumulira izuzetno niske razine JA, također slabo reagira na tretman MeJA u smislu rekonfiguracije metaboloma. Ovi rezultati ukazuju na to da je proizvodnja JA ili prijenos signala fiziološki ograničena kod vrsta koje ne reagiraju na signal. Kako bismo testirali ovu hipotezu, proučavali smo četiri vrste (N. pallens, N. mills, N. pink i N. microphylla) inducirane transkriptomom W + W, W + OSM i W + OSS1 (39). U skladu s obrascem preoblikovanja metaboloma, vrste su dobro odvojene u transkriptomskom prostoru, među kojima je N. attenuated pokazao najveći OS-inducirani RDPI, dok je N. gracilis imao najniži (Slika 6A). Međutim, utvrđeno je da je raznolikost transkriptoma inducirana s N. oblonga bila najniža među četiri vrste, suprotno najvećoj metabonomskoj raznolikosti N. oblonga prethodno prikazanoj kod sedam vrsta. Prethodne studije pokazale su da skup gena povezanih s ranim obrambenim signalima, uključujući JA signale, objašnjava specifičnost ranih obrambenih odgovora induciranih elicitorima povezanim s biljojedima kod vrsta Nicotiana (39). Usporedba JA signalnih putova između ove četiri vrste otkrila je zanimljiv obrazac (Slika 6B). Većina gena u ovom putu, poput AOC, OPR3, ACX i COI1, pokazala je relativno visoke razine indukcije u ove četiri vrste. Međutim, ključni gen, JAR4, pretvara JA u njegov biološki aktivni oblik akumuliranih transkripata JA-Ile, a njegova razina transkripcije je vrlo niska, posebno u N. mills, Nepenthes pieris i N. microphylla. Osim toga, samo transkript drugog gena AOS nije otkriven u N. bifidum. Ove promjene u ekspresiji gena mogu biti odgovorne za ekstremne fenotipove izazvane niskom produkcijom JA u signalno anergičnim vrstama i indukcijom N. gracilis.
(A) Analiza informacijske teorije reprogramiranja ranih transkripcijskih odgovora četiri blisko srodne vrste duhana uzorkovane 30 minuta nakon indukcije biljojeda. RDPI se izračunava usporedbom listova induciranih OS biljojeda s kontrolnom skupinom rane. Boje označavaju različite vrste, a simboli različite metode tretmana. (B) Analiza ekspresije gena u JA signalnim putovima među četiri vrste. Pojednostavljeni JA put prikazan je pored kutijastog dijagrama. Različite boje označavaju različite metode obrade. Zvjezdica označava da postoji značajna razlika između tretmana W + OS i kontrole W + W (za Studentov t-test za parne razlike, *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001). OPDA, 12-oksofitodienska kiselina; OPC-8: 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenil)-ciklopentan-1-oktanska kiselina.
U posljednjem dijelu proučavali smo kako specifično preoblikovanje metaboloma različitih biljnih vrsta kod insekata može biti otporno na biljojede. Prethodna istraživanja naglašavala su rod Nicotiana. Njihova otpornost na Ms i ličinke uvelike se razlikuje (40). Ovdje smo proučavali vezu između ovog modela i njihove metaboličke plastičnosti. Koristeći gore navedene četiri vrste duhana i testirajući korelaciju između raznolikosti i specijalizacije metaboloma uzrokovanog biljojedima i otpornosti biljaka na Ms i Sl, otkrili smo da su otpornost, raznolikost i specijalizacija na generalistički Sl sve pozitivno korelirane, dok je korelacija između otpornosti na stručnjake i specijalizacije slaba, a korelacija s raznolikošću nije značajna (Slika S10). Što se tiče otpornosti na S1, i atenuirani N. chinensis i N. gracilis, za koje je prethodno pokazano da pokazuju i razinu JA signalne transdukcije i plastičnost metaboloma, imali su uvelike različite odgovore na indukciju biljojeda, a također su pokazali sličnu visoku otpornost. Spol.
U proteklih šezdeset godina, teorija obrane biljaka pružila je teorijski okvir na temelju kojeg su istraživači predvidjeli znatan broj evolucije i funkcija specijaliziranih metabolita biljaka. Većina tih teorija ne slijedi uobičajeni postupak jakih zaključaka (41). One predlažu ključna predviđanja (3) na istoj razini analize. Kada testiranje ključnih predviđanja omogući analizu specifičnih teorija, to će učiniti područje naprednim. Biti podržan, ali odbaciti druge (42). Umjesto toga, nova teorija daje predviđanja na različitim razinama analize i dodaje novi sloj deskriptivnih razmatranja (42). Međutim, dvije teorije predložene na funkcionalnoj razini, MT i OD, mogu se lako objasniti kao važna predviđanja specijaliziranih metaboličkih promjena uzrokovanih biljojedima: OD teorija vjeruje da su promjene u specijaliziranom metaboličkom "prostoru" vrlo usmjerene. MT teorija vjeruje da će te promjene biti neusmjerene i nasumično smještene u metaboličkom prostoru te da imaju tendenciju imati metabolite visoke obrambene vrijednosti. Prethodna ispitivanja OD i MT predviđanja testirana su korištenjem uskog skupa a priori "obrambenih" spojeva. Ovi testovi usmjereni na metabolit onemogućuju analizu opsega i putanje rekonfiguracije metaboloma tijekom biljojeda i ne dopuštaju testiranje unutar konzistentnog statističkog okvira koje bi zahtijevalo ključna predviđanja koja se mogu smatrati cjelinom. Kvantificirajte promjene u biljnom metabolomu. Ovdje smo koristili inovativnu tehnologiju u metabolomici temeljenu na računalnom MS-u i proveli dekonvolucijsku MS analizu u općoj valuti deskriptora teorije informacija kako bismo testirali razliku između dva predložena na globalnoj razini metabolomike. Ključno predviđanje ove teorije. Teorija informacija primijenjena je u mnogim područjima, posebno u kontekstu istraživanja bioraznolikosti i protoka hranjivih tvari (43). Međutim, koliko znamo, ovo je prva primjena koja se koristi za opisivanje metaboličkog informacijskog prostora biljaka i rješavanje ekoloških problema povezanih s privremenim metaboličkim promjenama kao odgovor na znakove iz okoliša. Posebno, sposobnost ove metode leži u njezinoj sposobnosti usporedbe obrazaca unutar i između biljnih vrsta kako bi se ispitalo kako su biljojedi evoluirali od različitih vrsta do međuvrstnih makroevolucijskih obrazaca na različitim razinama evolucije. Metabolizam.
Analiza glavnih komponenti (PCA) pretvara multivarijatni skup podataka u prostor redukcije dimenzionalnosti tako da se može objasniti glavni trend podataka, pa se obično koristi kao istraživačka tehnika za parsiranje skupa podataka, poput dekonvolucijskog metaboloma. Međutim, redukcija dimenzionalnosti izgubit će dio informacijskog sadržaja u skupu podataka, a PCA ne može pružiti kvantitativne informacije o karakteristikama koje su posebno relevantne za ekološku teoriju, kao što su: kako biljojedi rekonfiguriraju raznolikost u specijaliziranim područjima (na primjer, bogatstvo, rasprostranjenost) i brojnost) metaboliti? Koji su metaboliti prediktori induciranog stanja određenog biljojeda? Iz perspektive specifičnosti, raznolikosti i inducibilnosti, informacijski sadržaj profila metabolita specifičnog za list se dekomponira i utvrđeno je da jedenje biljojeda može aktivirati specifični metabolizam. Neočekivano smo primijetili da, kao što je opisano u implementiranim indikatorima teorije informacija, rezultirajuća metabolička situacija ima veliko preklapanje nakon napada dvaju biljojeda (generalist koji se hrani noću Sl) i stručnjakinje za Solanaceae Ms. Iako su njihovo prehrambeno ponašanje i koncentracija značajno različiti. Inicijator konjugata masnih kiselina i aminokiselina (FAC) u OS (31). Korištenjem biljojednog OS za liječenje standardiziranih ubodnih rana, simulirani tretman biljojeda također je pokazao sličan trend. Ovaj standardizirani postupak za simuliranje odgovora biljaka na napade biljojeda eliminira zbunjujuće čimbenike uzrokovane promjenama u prehrambenom ponašanju biljojeda, koje dovode do različitih stupnjeva oštećenja u različito vrijeme (34). FAC, za koji se zna da je glavni uzrok OSM-a, smanjuje odgovore JAS-a i drugih biljnih hormona u OSS1, dok OSS1 smanjuje stotine puta (31). Međutim, OSS1 je uzrokovao slične razine akumulacije JA u usporedbi s OSM-om. Prethodno je pokazano da je odgovor JA u atenuiranim Nepenthesima vrlo osjetljiv na OSM, gdje FAC može održati svoju aktivnost čak i ako je razrijeđen 1:1000 s vodom (44). Stoga, u usporedbi s OSM-om, iako je FAC u OSS1 vrlo nizak, dovoljan je za izazivanje dovoljne izbijanja JA. Prethodne studije su pokazale da se proteini slični porinu (45) i oligosaharidi (46) mogu koristiti kao molekularni tragovi za pokretanje obrambenih odgovora biljaka u OSS1. Međutim, još uvijek nije jasno jesu li ovi elicitori u OSS1 odgovorni za nakupljanje JA uočeno u trenutnoj studiji.
Iako postoji malo studija koje opisuju različite metaboličke otiske prstiju uzrokovane primjenom različitih biljojeda ili egzogenih JA ili SA (salicilne kiseline) (47), nitko nije poremetio perturbaciju specifičnu za vrstu biljojeda u mreži biljaka i njezine učinke na specifične osobne podatke. Ukupni utjecaj metabolizma sustavno se proučava. Ova analiza dodatno je potvrdila da veza unutarnje hormonske mreže s drugim biljnim hormonima osim JA oblikuje specifičnost metaboličke reorganizacije uzrokovane biljojedima. Posebno smo otkrili da je ET uzrokovan OSM-om bio značajno veći od onog uzrokovanog OSS1. Ovaj način rada u skladu je s većim sadržajem FAC-a u OSM-u, što je nužan i dovoljan uvjet za pokretanje ET naleta (48). U kontekstu interakcije između biljaka i biljojeda, signalna funkcija ET-a na dinamiku metabolita specifičnih za biljke još uvijek je sporadična i cilja samo na jednu skupinu spojeva. Osim toga, većina studija koristila je egzogenu primjenu ET-a ili njegovih prekursora ili različitih inhibitora za proučavanje regulacije ET-a, među kojima će ove egzogene kemijske primjene proizvesti mnoge nespecifične nuspojave. Koliko znamo, ova studija predstavlja prvo veliko sustavno ispitivanje uloge ET-a u korištenju ET-a za proizvodnju i percepciju oštećenih transgeničnih biljaka radi koordinacije dinamike biljnog metaboloma. Indukcija ET-a specifična za biljojede u konačnici može modulirati odgovor metaboloma. Najznačajnija je transgenična manipulacija genima biosinteze (ACO) i percepcije (ETR1) ET-a koja je otkrila de novo akumulaciju fenolamida specifičnu za biljojede. Prethodno je pokazano da ET može fino podesiti akumulaciju nikotina induciranu JA reguliranjem putrescin N-metiltransferaze (49). Međutim, s mehaničkog gledišta, nije jasno kako ET fino podešava indukciju fenamida. Osim funkcije prijenosa signala ET-a, metabolički tok može se preusmjeriti i na S-adenozil-1-metionin kako bi se reguliralo ulaganje u poliaminofenol amide. S-adenozil-1-metionin je ET i uobičajeni međuprodukt biosintetskog puta poliamina. Mehanizam kojim ET signal regulira razinu fenolamida treba daljnje proučavanje.
Dugo vremena, zbog velikog broja posebnih metabolita nepoznate strukture, intenzivna pozornost posvećena specifičnim metaboličkim kategorijama nije bila u mogućnosti strogo procijeniti vremenske promjene metaboličke raznolikosti nakon bioloških interakcija. Trenutno, na temelju analize teorije informacija, glavni rezultat MS/MS spektra na temelju nepristranih metabolita jest da biljojedi koji jedu ili simuliraju biljojede nastavljaju smanjivati ​​ukupnu metaboličku raznolikost metaboloma lista, a istovremeno povećavaju stupanj njegove specijalizacije. Ovo privremeno povećanje specifičnosti metaboloma uzrokovano biljojedima povezano je sa sinergističkim povećanjem specifičnosti transkriptoma. Značajka koja najviše doprinosi ovoj većoj specijalizaciji metaboloma (s višom vrijednošću Si) je poseban metabolit s prethodno karakteriziranom biljojednom funkcijom. Ovaj model je u skladu s predviđanjem teorije OD, ali predviđanje MT-a povezano sa slučajnošću reprogramiranja metaboloma nije konzistentno. Međutim, ovi podaci su također u skladu s predviđanjem miješanog modela (najbolji MT; slika 1B), jer drugi nekarakterizirani metaboliti s nepoznatim obrambenim funkcijama i dalje mogu slijediti slučajnu distribuciju Si.
Značajan obrazac koji je dodatno uočeno ovim istraživanjem jest da su od mikroevolucijske razine (pojedinačna biljka i populacija duhana) do veće evolucijske skale (blisko srodne vrste duhana), različite razine evolucijske organizacije u „najboljoj obrani“. Postoje značajne razlike u sposobnostima biljojeda. Moore i sur. (20) te Kessler i Kalske (1) neovisno su predložili pretvaranje tri funkcionalne razine bioraznolikosti koje je izvorno razlikovao Whittaker (50) u konstitutivne i inducirane vremenske promjene kemijske raznolikosti; ni ovi autori nisu saželi postupke za prikupljanje podataka o metabolomima velikih razmjera također ne opisuju kako izračunati metaboličku raznolikost iz tih podataka. U ovoj studiji, manje prilagodbe Whittakerove funkcionalne klasifikacije razmatrat će α-metaboličku raznolikost kao raznolikost MS/MS spektara u određenoj biljci, a β-metaboličku raznolikost kao osnovni intraspecifični metabolizam skupine populacija, a γ-metaboličku raznolikost bit će proširenje analize sličnih vrsta.
JA signal je bitan za širok raspon metaboličkih odgovora biljojeda. Međutim, nedostaje rigorozno kvantitativno testiranje doprinosa intraspecifične regulacije biosinteze JA raznolikosti metaboloma, a još uvijek nije jasno je li JA signal opće mjesto za metaboličku diverzifikaciju induciranu stresom na višoj makroevolucijskoj skali. Primijetili smo da biljojeda priroda biljojeda Nepenthes inducira specijalizaciju metaboloma, a varijacija specijalizacije metaboloma unutar populacije vrsta Nicotiana i među blisko srodnim vrstama Nicotiana sustavno je pozitivno korelirana s JA signalizacijom. Osim toga, kada je JA signal oštećen, metabolička specifičnost izazvana jednim genotipom biljojeda bit će poništena (Slika 3, C i E). Budući da su promjene metaboličkog spektra prirodno atenuiranih populacija Nepenthes uglavnom kvantitativne, promjene u metaboličkoj β raznolikosti i specifičnosti u ovoj analizi mogu biti uvelike uzrokovane snažnom ekscitacijom kategorija spojeva bogatih metabolitima. Ove klase spojeva dominiraju dijelom profila metaboloma i dovode do pozitivne korelacije s JA signalima.
Budući da su biokemijski mehanizmi vrsta duhana koje su mu blisko povezane vrlo različiti, metaboliti su specifično identificirani u kvalitativnom aspektu, pa je to analitičnije. Obrada snimljenog metaboličkog profila informacijskom teorijom otkriva da indukcija biljojeda pogoršava kompromis između metaboličke gama raznolikosti i specijalizacije. JA signal igra središnju ulogu u ovom kompromisu. Povećanje specijalizacije metaboloma u skladu je s glavnim predviđanjem OD i pozitivno je korelirano s JA signalom, dok je JA signal negativno koreliran s metaboličkom gama raznolikošću. Ovi modeli pokazuju da je OD kapacitet biljaka uglavnom određen plastičnošću JA, bilo na mikroevolucijskoj skali ili na većoj evolucijskoj skali. Eksperimenti primjene egzogenog JA koji zaobilaze defekte biosinteze JA dodatno otkrivaju da se blisko povezane vrste duhana mogu razlikovati u vrste koje reagiraju na signal i vrste koje ne reagiraju na signal, baš kao i njihov način JA i plastičnost metaboloma inducirana biljojedima. Vrste koje ne reagiraju na signal ne mogu reagirati zbog svoje nemogućnosti proizvodnje endogenog JA i stoga su podložne fiziološkim ograničenjima. To bi moglo biti uzrokovano mutacijama u nekim ključnim genima u JA signalnom putu (AOS i JAR4 u N. crescens). Ovaj rezultat naglašava da bi ovi međuvrsni makroevolucijski obrasci mogli biti uglavnom potaknuti promjenama u percepciji i odgovoru unutarnjih hormona.
Uz interakciju između biljaka i biljojeda, istraživanje metaboličke raznolikosti povezano je sa svim važnim teorijskim napretkom u istraživanju biološke prilagodbe okolišu i evolucije složenih fenotipskih osobina. S povećanjem količine podataka prikupljenih modernim MS instrumentima, testiranje hipoteza o metaboličkoj raznolikosti sada može nadilaziti individualne/kategorijske razlike u metabolitima i provoditi globalnu analizu kako bi se otkrili neočekivani obrasci. U procesu analize velikih razmjera, važna metafora je ideja osmišljavanja značajnih karata koje se mogu koristiti za istraživanje podataka. Stoga je važan rezultat trenutne kombinacije nepristrane MS/MS metabolomike i teorije informacija to što pruža jednostavnu metriku koja se može koristiti za izradu karata za pregledavanje metaboličke raznolikosti na različitim taksonomskim skalama. To je osnovni zahtjev ove metode. Proučavanje mikro/makro evolucije i ekologije zajednice.
Na makroevolucijskoj razini, srž teorije koevolucije biljaka i kukaca Ehrlicha i Ravena (51) jest predviđanje da je varijacija međuvrsne metaboličke raznolikosti uzrok diverzifikacije biljnih loza. Međutim, u pedeset godina od objavljivanja ovog temeljnog rada, ova je hipoteza rijetko testirana (52). To je uglavnom zbog filogenetskih karakteristika usporedivih metaboličkih karakteristika u biljnim lozama na velike udaljenosti. Rijetkost se može koristiti za sidrenje metoda analize ciljeva. Trenutni MS/MS tijek rada obrađen teorijom informacija kvantificira strukturnu sličnost MS/MS nepoznatih metabolita (bez prethodnog odabira metabolita) i pretvara te MS/MS u skup MS/MS, tako da se u profesionalnom metabolizmu ovi makroevolucijski modeli uspoređuju u klasifikacijskoj ljestvici. Jednostavni statistički pokazatelji. Proces je sličan filogenetskoj analizi, koja može koristiti poravnanje sekvenci za kvantificiranje stope diverzifikacije ili evolucije karaktera bez prethodnog predviđanja.
Na biokemijskoj razini, hipoteza probira Firna i Jonesa (53) pokazuje da se metabolička raznolikost održava na različitim razinama kako bi se osigurale sirovine za ostvarivanje bioloških aktivnosti prethodno nepovezanih ili supstituiranih metabolita. Metode teorije informacija pružaju okvir u kojem se ovi evolucijski prijelazi specifični za metabolite koji se javljaju tijekom specijalizacije metabolita mogu kvantificirati kao dio predloženog evolucijskog procesa probira: biološki aktivna adaptacija od niske specifičnosti do visoke specifičnosti. Inhibirani metaboliti danog okruženja.
Sve u svemu, u ranim danima molekularne biologije razvijene su važne teorije obrane biljaka, a deduktivne metode utemeljene na hipotezama općenito se smatraju jedinim sredstvom znanstvenog napretka. To je uglavnom zbog tehničkih ograničenja mjerenja cijelog metaboloma. Iako su metode utemeljene na hipotezama posebno korisne u odabiru drugih uzročnih mehanizama, njihova sposobnost da unaprijede naše razumijevanje biokemijskih mreža ograničenija je od računalnih metoda koje su trenutno dostupne u suvremenoj znanosti koja intenzivno koristi podatke. Stoga su teorije koje se ne mogu predvidjeti daleko izvan dosega dostupnih podataka, pa se hipotetska formula/ciklus testiranja napretka u području istraživanja ne može ukinuti (4). Predviđamo da računalni tijek rada metabolomike predstavljen ovdje može ponovno probuditi interes za nedavna (kako) i konačna (zašto) pitanja metaboličke raznolikosti te doprinijeti novoj eri teoretski vođene znanosti o podacima. Era je ponovno ispitala važne teorije koje su inspirirale prethodne generacije.
Izravno hranjenje biljojeda provodi se uzgojem ličinke drugog stadija ili ličinke Sl na jednom listu blijedoobojene biljke vrča jedne biljke u cvatu ruže, s 10 biljnih replikata po biljci. Ličinke kukaca su stegnute stezaljkama, a preostalo tkivo lista je prikupljeno 24 i 72 sata nakon infekcije i brzo zamrznuto, a metaboliti su ekstrahirani.
Simulirajte tretman biljojeda na visoko sinkroniziran način. Metoda je korištenje kotača s uzorkom tkanine za probijanje tri reda trnja sa svake strane srednjeg rebra tri potpuno razvijena lista biljke tijekom faze rasta tkanine, te odmah nanošenje 1:5 razrijeđenog Ms. Ili upotrijebite rukavice za umetanje S1 OS u ubodnu ranu. Uberite i obradite list kako je gore opisano. Koristite prethodno opisanu metodu za ekstrakciju primarnih metabolita i biljnih hormona (54).
Za egzogene primjene JA, tri peteljka lista svake od šest biljaka ruža u cvatu svake vrste tretiraju se s 20 μl lanolinske paste koja sadrži 150 μg MeJA (Lan + MeJA) i 20 μl lanolina plus tretman za rane (Lan + W) ili se koristi 20 μl čistog lanolina kao kontrola. Listovi su ubrani 72 sata nakon tretmana, brzo zamrznuti u tekućem dušiku i pohranjeni na -80 °C do upotrebe.
U našoj istraživačkoj skupini identificirane su četiri transgene linije JA i ET, i to irAOC (36), irCOI1 (55), irACO i sETR1 (48). IrAOC je pokazao snažno smanjenje razina JA i JA-Ile, dok irCOI1 nije bio osjetljiv na JA. U usporedbi s EV, akumulacija JA-Ile se povećala. Slično tome, irACO će smanjiti proizvodnju ET-a, a u usporedbi s EV, sETR1, koji je neosjetljiv na ET, povećat će proizvodnju ET-a.
Za neinvazivno mjerenje ET-a koristi se fotoakustični laserski spektrometar (Sensor Sense ETD-300 senzor ET u stvarnom vremenu). Odmah nakon tretmana, polovica listova je prerezana i prebačena u zatvorenu staklenu bočicu od 4 ml, a prostor iznad tekućine je ostavljen da se akumulira unutar 5 sati. Tijekom mjerenja, svaka bočica je ispirana strujom od 2 litre/sat čistog zraka tijekom 8 minuta, koji je prethodno prošao kroz katalizator koji je osigurao Sensor Sense za uklanjanje CO2 i vode.
Podaci mikročipa izvorno su objavljeni u (35) i spremljeni u sveobuhvatnoj bazi podataka o ekspresiji gena Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) (pristupni broj GSE30287). Za ovu studiju izdvojeni su podaci koji odgovaraju lišću uzrokovanom tretmanom W + OSM-ovima i neoštećenoj kontroli. Sirovi intenzitet je log2. Prije statističke analize, osnovna vrijednost je pretvorena i normalizirana na svoj 75. percentil pomoću softverskog paketa R.
Izvorni podaci sekvenciranja RNA (RNA-seq) vrsta Nicotiana preuzeti su iz NCBI Short Reading Archives (SRA), broj projekta je PRJNA301787, o čemu su izvijestili Zhou i suradnici (39), a postupak je opisan u (56). Sirovi podaci obrađeni pomoću W + W, W + OSM i W + OSS1 koji odgovaraju vrstama Nicotiana odabrani su za analizu u ovoj studiji i obrađeni na sljedeći način: Prvo, sirovi očitanja sekvenciranja RNA pretvoreni su u FASTQ format. HISAT2 pretvara FASTQ u SAM, a SAMtools pretvara SAM datoteke u sortirane BAM datoteke. StringTie se koristi za izračun ekspresije gena, a njegova metoda ekspresije je da postoje fragmenti na tisuću baznih fragmenata na milijun sekvenciranih transkripcijskih fragmenata.
Acclaim kromatografska kolona (150 mm x 2,1 mm; veličina čestica 2,2 μm) korištena u analizi i zaštitna kolona 4 mm x 4 mm izrađene su od istog materijala. Sljedeći binarni gradijent koristi se u sustavu tekućinske kromatografije ultra visoke učinkovitosti (UHPLC) Dionex UltiMate 3000: 0 do 0,5 minuta, izokratski 90% A [deionizirana voda, 0,1% (v/v) acetonitrila i 0,05% mravlje kiseline], 10% B (acetonitril i 0,05% mravlje kiseline); 0,5 do 23,5 minuta, gradijentna faza je 10% A i 90% B; 23,5 do 25 minuta, izokratski 10% A i 90% B. Brzina protoka je 400 μl/min. Za sve MS analize, eluent kolone ubrizgajte u kvadrupolni i vremenski mjereni (qTOF) analizator opremljen izvorom elektrospreja koji radi u načinu pozitivne ionizacije (napon kapile, 4500 V; izlaz kapile 130 V; temperatura sušenja 200 °C; protok zraka za sušenje 10 litara/min).
Provedite MS/MS analizu fragmenata (u daljnjem tekstu MS/MS) koji su irelevantni ili se ne mogu razlikovati od podataka kako biste dobili strukturne informacije o ukupnom detektabilnom metaboličkom profilu. Koncept neselektivne MS/MS metode oslanja se na činjenicu da kvadrupol ima vrlo veliki prozor izolacije mase [stoga, sve signale omjera mase i naboja (m/z) smatrajte fragmentima]. Iz tog razloga, budući da instrument Impact II nije mogao stvoriti CE nagib, provedeno je nekoliko neovisnih analiza korištenjem povećanih vrijednosti energije disocijacije sudara (CE) inducirane sudarima. Ukratko, prvo analizirajte uzorak UHPLC-elektrosprejnom ionizacijom/qTOF-MS korištenjem načina rada s jednom masenom spektrometrijom (uvjeti niske fragmentacije generirani fragmentacijom u izvoru), skenirajući od m/z 50 do 1500 pri frekvenciji ponavljanja od 5 Hz. Koristite dušik kao plin za sudare za MS/MS analizu i provedite neovisna mjerenja pri sljedeća četiri različita napona disocijacije inducirane sudarima: 20, 30, 40 i 50 eV. Tijekom cijelog procesa mjerenja, kvadrupol ima najveći prozor izolacije mase, od m/z 50 do 1500. Kada je eksperiment m/z prednjeg tijela i širine izolacije postavljen na 200, raspon mase automatski se aktivira operativnim softverom instrumenta i 0 Da. Skenirajte fragmente mase kao u načinu rada s jednom masom. Za kalibraciju mase koristite natrijev format (50 ml izopropanola, 200 μl mravlje kiseline i 1 ml 1M vodene otopine NaOH). Korištenjem Brukerovog algoritma za kalibraciju visoke preciznosti, datoteka podataka kalibrira se nakon pokretanja prosječnog spektra u zadanom vremenskom razdoblju. Koristite funkciju izvoza softvera Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Njemačka) za pretvaranje sirovih datoteka podataka u NetCDF format. Skup podataka MS/MS spremljen je u otvorenu metabolomsku bazu podataka MetaboLights (www.ebi.ac.uk) s pristupnim brojem MTBLS1471.
MS/MS sastavljanje može se ostvariti analizom korelacije između MS1 i MS/MS signala kvalitete za nisku i visoku energiju sudara te novo implementiranim pravilima. R skripta se koristi za realizaciju analize korelacije raspodjele prekursora produkta, a C# skripta (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) se koristi za implementaciju pravila.
Kako bismo smanjili lažno pozitivne pogreške uzrokovane pozadinskom bukom i lažnu korelaciju uzrokovanu detekcijom određenih m/z značajki u samo nekoliko uzoraka, koristimo funkciju "popunjenog vrha" R paketa XCMS (za korekciju pozadinske buke) koja bi se trebala koristiti za zamjenu intenziteta "NA" (nedetektovanog vrha). Kada se koristi funkcija popunjenog vrha, u skupu podataka još uvijek postoji mnogo vrijednosti intenziteta "0" koje će utjecati na izračun korelacije. Zatim uspoređujemo rezultate obrade podataka dobivene kada se koristi funkcija popunjenog vrha i kada se ne koristi funkcija popunjenog vrha, te izračunavamo vrijednost pozadinske buke na temelju prosječne korigirane procijenjene vrijednosti, a zatim zamjenjujemo te vrijednosti intenziteta od 0 izračunatom pozadinskom vrijednošću. Također smo uzeli u obzir samo značajke čiji je intenzitet tri puta premašio pozadinsku vrijednost i smatrali ih "pravim vrhovima". Za PCC izračune uzimaju se u obzir samo m/z signali prethodnika uzorka (MS1) i fragmenta s najmanje osam pravih vrhova.
Ako je intenzitet obilježja kvalitete prekursora u cijelom uzorku značajno koreliran sa smanjenim intenzitetom istog obilježja kvalitete koje je podvrgnuto niskoj ili visokoj energiji sudara, a obilježje nije označeno kao izotopski vrh pomoću CAMERA programa, može se dalje definirati. Zatim se, izračunavanjem svih mogućih parova prekursor-produkt unutar 3 s (procijenjeni vremenski prozor zadržavanja za zadržavanje vrha), provodi korelacijska analiza. Samo kada je vrijednost m/z niža od vrijednosti prekursora i MS/MS fragmentacija se dogodi na istoj lokaciji uzorka u skupu podataka kao i prekursor iz kojeg je izveden, smatra se fragmentom.
Na temelju ova dva jednostavna pravila isključujemo određene fragmente s m/z vrijednostima većim od m/z identificiranog prekursora, te na temelju položaja uzorka gdje se prekursor pojavljuje i određenog fragmenta. Također je moguće odabrati značajke kvalitete generirane mnogim fragmentima u izvoru generiranim u MS1 ​​modu kao kandidate za prekursore, čime se generiraju redundantni MS/MS spojevi. Kako bismo smanjili ovu redundantnost podataka, ako NDP sličnost spektara prelazi 0,6 i pripadaju kromatogramu "pcgroup" označenom s CAMERA, spojit ćemo ih. Konačno, spajamo sva četiri CE rezultata povezana s prekursorom i fragmentima u konačni dekonvoluirani kompozitni spektar odabirom vrha najvećeg intenziteta među svim kandidatima za vrhove s istom m/z vrijednošću pri različitim energijama sudara. Sljedeći koraci obrade temelje se na konceptu kompozitnog spektra i uzimaju u obzir različite CE uvjete potrebne za maksimiziranje vjerojatnosti fragmentacije, jer se neki fragmenti mogu detektirati samo pod određenom energijom sudara.
RDPI (30) korišten je za izračun inducibilnosti metaboličkog profila. Raznolikost metaboličkog spektra (Hj indeks) izvedena je iz obilja MS/MS prekursora korištenjem Shannonove entropije MS/MS frekvencijske distribucije koristeći sljedeću jednadžbu koju su opisali Martínez i suradnici (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) gdje Pij odgovara relativnoj frekvenciji i-tog MS/MS u j-tom uzorku (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m)t).
Metabolička specifičnost (Si indeks) definirana je kao identitet ekspresije danog MS/MS u odnosu na učestalost između razmatranih uzoraka. Specifičnost MS/MS izračunava se kao Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Za mjerenje metabolomski specifičnog δj indeksa svakog j-tog uzorka i prosjeka MS/MS specifičnosti δj = ∑i = 1mPijSi upotrijebite sljedeću formulu
MS/MS spektri su poravnati u parovima, a sličnost se izračunava na temelju dva rezultata. Prvo, korištenjem standardnog NDP-a (također poznatog kao metoda kosinusne korelacije), upotrijebite sljedeću jednadžbu za ocjenjivanje sličnosti segmenta između spektara NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 gdje S1 i S2 Odnosno, za spektar 1 i spektar 2, kao i WS1, i i WS2, i predstavlja težinu na temelju intenziteta vrha gdje je razlika i-tog zajedničkog vrha između dva spektra manja od 0,01 Da. Težina se izračunava na sljedeći način: W = [intenzitet vrha] m [kvaliteta] n, m = 0,5, n = 2, kako predlaže MassBank.
Implementirana je druga metoda bodovanja koja je uključivala analizu zajedničkog NL-a između MS/MS. U tu svrhu koristili smo 52 NL liste koje se često susreću tijekom procesa fragmentacije MS zajedno i specifičniji NL (datoteka podataka S1) koji je prethodno označen za MS/MS spektar sekundarnih metabolita oslabljene vrste Nepenthes (9, 26). Stvorite binarni vektor od 1 i 0 za svaki MS/MS, koji odgovara trenutnom i nepostojećem nekom NL-u. Na temelju sličnosti euklidske udaljenosti, rezultat sličnosti NL-a izračunava se za svaki par binarnih NL vektora.
Za izvođenje dvostrukog grupiranja koristili smo R paket DiffCoEx, koji se temelji na proširenju analize ponderirane genske koekspresije (WGCNA). Koristeći NDP i NL matrice bodovanja MS/MS spektara, koristili smo DiffCoEx za izračun matrice komparativne korelacije. Binarno grupiranje provodi se postavljanjem parametra „cutreeDynamic“ na method = „hybrid“, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T i minClusterSize = 10. Izvorni R kod DiffCoEx-a preuzet je iz dodatne datoteke 1 od strane Tessona i suradnika (57); Potreban R WGCNA softverski paket može se pronaći na https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Kako bismo proveli MS/MS analizu molekularne mreže, izračunali smo sparenu spektralnu povezanost na temelju tipova sličnosti NDP i NL te koristili Cytoscape softver za vizualizaciju topologije mreže korištenjem organskog izgleda u aplikaciji za proširenje algoritma izgleda CyFilescape yFiles.
Za statističku analizu podataka upotrijebite R verziju 3.0.1. Statistička značajnost procijenjena je dvosmjernom analizom varijance (ANOVA), nakon čega je uslijedio Tukeyjev post-hoc test značajne razlike (HSD). Kako bi se analizirala razlika između tretmana biljojeda i kontrole, dvostrana distribucija dviju skupina uzoraka s istom varijancom analizirana je Studentovim t-testom.
Za dodatne materijale za ovaj članak, pogledajte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod uvjetima Creative Commons licence Imenovanje-Nekomercijalno, koja dopušta korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, sve dok konačna upotreba nije u komercijalne svrhe i pretpostavka je da je izvorno djelo ispravno. Referenca.
Napomena: Molimo vas da navedete svoju adresu e-pošte samo kako bi osoba koju preporučite stranici znala da želite da vidi e-poštu i da se ne radi o neželjenoj pošti. Nećemo prikupljati nikakve adrese e-pošte.
Ovo pitanje se koristi za provjeru jeste li posjetitelj i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
Teorija informacija pruža univerzalnu valutu za usporedbu posebnih metaboloma i predviđanje teorija obrane od testiranja.
Teorija informacija pruža univerzalnu valutu za usporedbu posebnih metaboloma i predviđanje teorija obrane od testiranja.
©2021 Američka udruga za napredak znanosti. sva prava pridržana. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.