Članak je dio istraživačke teme „Poboljšanje otpornosti mahunarki na patogene i štetnike“, pogledajte svih 5 članaka
Uzročnik gljivične bolesti nekroze biljaka Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary koristi višeslojnu strategiju za zarazu različitih biljaka domaćina. Ova studija predlaže upotrebu diamina L-ornitina, neproteinske aminokiseline koja stimulira sintezu drugih esencijalnih aminokiselina, kao alternativnu strategiju upravljanja za poboljšanje molekularnih, fizioloških i biokemijskih odgovora Phaseolus vulgaris L. na bijelu plijesan uzrokovanu Pseudomonas sclerotiorum. In vitro eksperimenti pokazali su da L-ornitin značajno inhibira rast micelija S. pyrenoidosa na način ovisan o dozi. Štoviše, mogao bi značajno smanjiti ozbiljnost bijele plijesni u uvjetima staklenika. Nadalje, L-ornitin je stimulirao rast tretiranih biljaka, što ukazuje na to da testirane koncentracije L-ornitina nisu bile fitotoksične za tretirane biljke. Osim toga, L-ornitin je pojačao ekspresiju neenzimskih antioksidansa (ukupni topljivi fenoli i flavonoidi) i enzimskih antioksidansa (katalaza (CAT), peroksidaza (POX) i polifenol oksidaza (PPO)), te povećao ekspresiju tri gena povezana s antioksidansima (PvCAT1, PvSOD i PvGR). Nadalje, in silico analiza otkrila je prisutnost pretpostavljenog proteina oksaloacetat acetilhidrolaze (SsOAH) u genomu S. sclerotiorum, koji je bio vrlo sličan proteinima oksaloacetat acetilhidrolaze (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) i Penicillium sp. (PlOAH) u smislu funkcionalne analize, konzerviranih domena i topologije. Zanimljivo je da je dodatak L-ornitina u medij krumpirove dekstrozne juhe (PDB) značajno smanjio ekspresiju gena SsOAH u miceliju S. sclerotiorum. Slično tome, egzogena primjena L-ornitina značajno je smanjila ekspresiju gena SsOAH u gljivičnom miceliju prikupljenom s tretiranih biljaka. Konačno, primjena L-ornitina značajno je smanjila lučenje oksalne kiseline i u PDB mediju i u zaraženom lišću. Zaključno, L-ornitin igra ključnu ulogu u održavanju redoks statusa, kao i u poboljšanju obrambenog odgovora zaraženih biljaka. Rezultati ove studije mogu pomoći u razvoju inovativnih, ekološki prihvatljivih metoda za kontrolu bijele plijesni i ublažavanje njezinog utjecaja na proizvodnju graha i drugih usjeva.
Bijela plijesan, koju uzrokuje nekrotrofna gljivica Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, razorna je bolest koja smanjuje prinos i predstavlja ozbiljnu prijetnju globalnoj proizvodnji graha (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton i sur., 2006.). Sclerotinia sclerotiorum jedan je od najtežih za suzbijanje gljivičnih biljnih patogena koji se prenose tlu, sa širokim rasponom domaćina od preko 600 biljnih vrsta i sposobnošću brze maceracije tkiva domaćina na nespecifičan način (Liang i Rollins, 2018.). U nepovoljnim uvjetima prolazi kroz kritičnu fazu svog životnog ciklusa, ostajući mirujući dulje vrijeme kao crne, tvrde, sjemenkama slične strukture zvane 'sklerocije' u tlu ili kao bijele, pahuljaste izrasline u miceliju ili srži stabljike zaraženih biljaka (Schwartz i sur., 2005.). S. sclerotiorum sposoban je stvarati sklerocije, što mu omogućuje dulje preživljavanje na zaraženim poljima i opstanak tijekom bolesti (Schwartz i sur., 2005.). Sklerocije su bogate hranjivim tvarima, mogu dugo opstati u tlu i služe kao primarni inokulum za naknadne infekcije (Schwartz i sur., 2005.). U povoljnim uvjetima, sklerocije klijaju i proizvode spore u zraku koje mogu zaraziti sve nadzemne dijelove biljke, uključujući, ali ne ograničavajući se na cvjetove, stabljike ili mahune (Schwartz i sur., 2005.).
Sclerotinia sclerotiorum koristi višeslojnu strategiju za zarazu biljaka domaćina, koja uključuje niz koordiniranih događaja od klijanja sklerocija do razvoja simptoma. U početku, S. sclerotiorum proizvodi suspendirane spore (nazvane askospore) iz struktura sličnih gljivama koje se nazivaju apotecije, koje se prenose zrakom i razvijaju u nepokretne sklerocije na zaraženim biljnim ostacima (Bolton i sur., 2006.). Gljiva zatim luči oksalnu kiselinu, faktor virulencije, kako bi kontrolirala pH stanične stijenke biljke, potaknula enzimsku razgradnju i invaziju tkiva (Hegedus i Rimmer, 2005.) te suzbila oksidativni nalet biljke domaćina. Ovaj proces zakiseljavanja slabi staničnu stijenku biljke, pružajući povoljno okruženje za normalan i učinkovit rad enzima koji razgrađuju stanične stijenke gljivica (CWDE), omogućujući patogenu da prevlada fizičku barijeru i prodre u tkiva domaćina (Marciano i sur., 1983.). Nakon prodiranja, S. sclerotiorum izlučuje niz CWDE-a, poput poligalakturonaze ​​i celulaze, koji olakšavaju njegovo širenje u zaraženim tkivima i uzrokuju nekrozu tkiva. Napredovanje lezija i hifalnih podloga dovodi do karakterističnih simptoma bijele plijesni (Hegedus i Rimmer, 2005.). U međuvremenu, biljke domaćini prepoznaju molekularne obrasce povezane s patogenima (PAMP) putem receptora za prepoznavanje obrazaca (PRR), pokrećući niz signalnih događaja koji u konačnici aktiviraju obrambene odgovore.
Unatoč desetljećima napora u suzbijanju bolesti, u grahu, kao i u drugim komercijalnim kulturama, i dalje nedostaje odgovarajuće rezistentne germplazme zbog otpornosti, preživljavanja i prilagodljivosti patogena. Suzbijanje bolesti stoga je izuzetno izazovno i zahtijeva integriranu, višestruku strategiju koja uključuje kombinaciju agrotehničkih praksi, biološke kontrole i kemijskih fungicida (O'Sullivan i sur., 2021.). Kemijsko suzbijanje bijele plijesni najučinkovitije je jer fungicidi, kada se primjenjuju ispravno i u pravo vrijeme, mogu učinkovito kontrolirati širenje bolesti, smanjiti težinu infekcije i minimizirati gubitke prinosa. Međutim, prekomjerna upotreba i prekomjerno oslanjanje na fungicide može dovesti do pojave rezistentnih sojeva S. sclerotiorum i negativno utjecati na organizme koji nisu ciljne skupine, zdravlje tla i kvalitetu vode (Le Cointe i sur., 2016.; Ceresini i sur., 2024.). Stoga je pronalaženje ekološki prihvatljivih alternativa postalo glavni prioritet.
Poliamini (PA), poput putrescina, spermidina, spermina i kadaverina, mogu poslužiti kao obećavajuće alternative protiv biljnih patogena koji se prenose tlom, čime se potpuno ili djelomično smanjuje upotreba opasnih kemijskih fungicida (Nehela i sur., 2024.; Yi i sur., 2024.). U višim biljkama, PA su uključeni u mnoge fiziološke procese, uključujući, ali ne ograničavajući se na, diobu stanica, diferencijaciju i odgovor na abiotske i biotičke stresove (Killiny i Nehela, 2020.). Mogu djelovati kao antioksidansi, pomoći u uklanjanju reaktivnih vrsta kisika (ROS), održavati redoks homeostazu (Nehela i Killiny, 2023.), inducirati gene povezane s obranom (Romero i sur., 2018.), regulirati različite metaboličke putove (Nehela i Killiny, 2023.), modulirati endogene fitohormone (Nehela i Killiny, 2019.), uspostaviti sistemsku stečenu otpornost (SAR) i regulirati interakcije biljaka i patogena (Nehela i Killiny, 2020.; Asija i sur., 2022.; Czerwoniec, 2022.). Vrijedi napomenuti da specifični mehanizmi i uloge PA u obrani biljaka variraju ovisno o biljnoj vrsti, patogenima i uvjetima okoliša. Najzastupljenija PA u biljkama biosintetizira se iz esencijalnog poliamina L-ornitina (Killiny i Nehela, 2020.).
L-ornitin igra višestruke uloge u rastu i razvoju biljaka. Na primjer, prethodne studije su pokazale da kod riže (Oryza sativa) ornitin može biti povezan s recikliranjem dušika (Liu i sur., 2018.), prinosom, kvalitetom i aromom riže (Lu i sur., 2020.) te odgovorom na vodni stres (Yang i sur., 2000.). Nadalje, egzogena primjena L-ornitina značajno je poboljšala toleranciju na sušu kod šećerne repe (Beta vulgaris) (Hussein i sur., 2019.) i ublažila stres od soli kod biljaka luka (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu i Çavuşoǧlu, 2021.) i indijskog oraščića (Anacardium occidentale) (da Rocha i sur., 2012.). Potencijalna uloga L-ornitina u obrani od abiotičkog stresa može biti posljedica njegove uključenosti u akumulaciju prolina u tretiranim biljkama. Na primjer, prethodno je objavljeno da su geni povezani s metabolizmom prolina, poput gena ornitin delta aminotransferaze (delta-OAT) i prolin dehidrogenaze (ProDH1 i ProDH2), uključeni u obranu Nicotiana benthamiana i Arabidopsis thaliana od sojeva Pseudomonas syringae koji nisu domaćini (Senthil-Kumar i Mysore, 2012). S druge strane, gljivična ornitin dekarboksilaza (ODC) potrebna je za rast patogena (Singh i sur., 2020.). Ciljano djelovanje na ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici putem utišavanja gena induciranog domaćinom (HIGS) značajno je povećalo otpornost biljaka rajčice na uvenuće uzrokovano Fusariumom (Singh i sur., 2020.). Međutim, potencijalna uloga primjene egzogenog ornitina protiv biotičkih stresova poput fitopatogena nije dobro proučena. Što je još važnije, učinci ornitina na otpornost na bolesti i povezane biokemijske i fiziološke pojave ostaju uglavnom neistraženi.
Razumijevanje složenosti infekcije mahunarki bakterijom S. sclerotiorum važno je za razvoj učinkovitih strategija suzbijanja. U ovom istraživanju cilj nam je bio identificirati potencijalnu ulogu diamina L-ornitina kao ključnog čimbenika u jačanju obrambenih mehanizama i otpornosti biljaka mahunarki na infekciju Sclerotinia sclerotiorum. Pretpostavljamo da, osim što pojačava obrambene odgovore zaraženih biljaka, L-ornitin također igra ključnu ulogu u održavanju redoks statusa. Pretpostavljamo da su potencijalni učinci L-ornitina povezani s regulacijom enzimskih i neenzimskih antioksidativnih obrambenih mehanizama i interferencijom s faktorima patogenosti/virulencije gljivica i povezanim proteinima. Ova dvostruka funkcionalnost L-ornitina čini ga obećavajućim kandidatom za održivu strategiju ublažavanja utjecaja bijele plijesni i povećanja otpornosti uobičajenih usjeva mahunarki na ovaj snažan gljivični patogen. Rezultati ovog istraživanja mogu pomoći u razvoju inovativnih, ekološki prihvatljivih metoda za suzbijanje bijele plijesni i ublažavanje njezina utjecaja na proizvodnju mahunarki.
U ovom istraživanju, osjetljiva komercijalna sorta običnog graha, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), korištena je kao eksperimentalni materijal. Zdravo sjeme ljubazno je ustupio Odjel za istraživanje mahunarki, Institut za istraživanje ratarskih usjeva (FCRI), Poljoprivredni istraživački centar (ARC), Egipat. Pet sjemenki posijano je u plastične posude (unutarnji promjer 35 cm, dubina 50 cm) napunjene tlom zaraženim S. sclerotiorum u uvjetima staklenika (25 ± 2 °C, relativna vlažnost 75 ± 1%, 8 sati svjetla/16 sati tame). 7-10 dana nakon sjetve (DPS), sadnice su prorijeđene kako bi se u svakoj posudi ostavile samo dvije sadnice s ujednačenim rastom i tri potpuno razvijena lista. Sve biljke u posudama zalijevale su se jednom svaka dva tjedna i gnojile mjesečno preporučenom dozom za danu sortu.
Za pripremu L-ornitindiamina (poznatog i kao (+)-(S)-2,5-diaminopentanoična kiselina; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Njemačka) koncentracije od 500 mg/L, 50 mg je prvo otopljeno u 100 mL sterilne destilirane vode. Osnovna otopina je zatim razrijeđena i korištena u sljedećim eksperimentima. Ukratko, šest serija koncentracija L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/L) testirano je in vitro. Osim toga, sterilna destilirana voda korištena je kao negativna kontrola (Mock), a komercijalni fungicid „Rizolex-T“ 50%-tni vlaživi prašak (toklofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Governorate Gharbia, Egipat) korišten je kao pozitivna kontrola. Komercijalni fungicid „Rizolex-T“ testiran je in vitro u pet koncentracija (2, 4, 6, 8 i 10 mg/L).
Uzorci stabljika i mahuna običnog graha koji pokazuju tipične simptome bijele plijesni (stopa zaraze: 10–30%) prikupljeni su s komercijalnih farmi. Iako je većina zaraženog biljnog materijala identificirana prema vrsti/sorti (osjetljiva komercijalna sorta Giza 3), drugi, posebno oni nabavljeni s lokalnih tržnica, bili su nepoznate vrste. Sakupljeni zaraženi materijali prvo su površinski dezinficirani 0,5%-tnom otopinom natrijevog hipoklorita tijekom 3 minute, zatim nekoliko puta isprani sterilnom destiliranom vodom i obrisani suhim sterilnim filter papirom kako bi se uklonio višak vode. Zaraženi organi su zatim izrezani na male komadiće iz srednjeg tkiva (između zdravog i zaraženog tkiva), uzgajani na mediju krumpirovog dekstroznog agara (PDA) i inkubirani na 25 ± 2 °C s ciklusom od 12 sati svjetla/12 sati tame tijekom 5 dana kako bi se potaknulo stvaranje sklerocija. Metoda micelijskog vrha također je korištena za pročišćavanje gljivičnih izolata iz miješanih ili kontaminiranih kultura. Pročišćeni gljivični izolat prvo je identificiran na temelju svojih kulturnih morfoloških karakteristika, a zatim je na temelju mikroskopskih značajki potvrđeno da je S. sclerotiorum. Konačno, svi pročišćeni izolati testirani su na patogenost na osjetljivoj sorti običnog graha Giza 3 kako bi se zadovoljili Kochovi postulati.
Osim toga, najinvazivniji izolat S. sclerotiorum (izolat #3) dodatno je potvrđen na temelju sekvenciranja internog transkribiranog razmaknika (ITS) kako je opisano od strane White i sur., 1990.; Baturo-Ciesniewska i sur., 2017. Ukratko, izolati su uzgajani u juhi krumpirove dekstroze (PDB) i inkubirani na 25 ± 2 °C tijekom 5-7 dana. Zatim je sakupljen gljivični micelij, filtriran kroz gazu, dva puta ispran sterilnom vodom i osušen sterilnim filter papirom. Genomska DNA izolirana je pomoću Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kita (Kuramae-Izioka, 1997.; Atallah i sur., 2022., 2024.). Regija ITS rDNA je zatim amplificirana korištenjem specifičnog para primera ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; očekivana veličina: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska i sur., 2017.). Pročišćeni PCR produkti su poslani na sekvenciranje (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Sekvence ITS rDNA su sekvencirane dvosmjerno korištenjem Sangerove metode sekvenciranja. Sastavljene upitne sekvence su zatim uspoređene s najnovijim podacima u GenBank i Nacionalnom centru za biotehnološke informacije (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) korištenjem BLASTn softvera. Slijed upita uspoređen je s 20 drugih sojeva/izolata S. sclerotiorum preuzetih iz najnovijih podataka u NCBI GenBank (Dodatna tablica S1) korištenjem ClustalW-a u paketu za molekularnu evolucijsku genetiku (MEGA-11; verzija 11) (Kumar i sur., 2024.). Evolucijska analiza provedena je korištenjem metode maksimalne vjerojatnosti i općeg vremenski reverzibilnog modela supstitucije nukleotida (Nei i Kumar, 2000.). Prikazano je stablo s najvećom logaritamskom vjerojatnošću. Početno stablo za heurističko pretraživanje odabire se odabirom stabla s većom logaritamskom vjerojatnošću između stabla spajanja susjeda (NJ) (Kumar i sur., 2024.) i stabla maksimalne štedljivosti (MP). NJ stablo je konstruirano korištenjem matrice parnih udaljenosti izračunate korištenjem općeg vremenski reverzibilnog modela (Nei i Kumar, 2000.).
Antibakterijska aktivnost L-ornitina i baktericida „Rizolex-T“ određena je in vitro metodom difuzije u agaru. Metoda: Uzeti odgovarajuću količinu osnovne otopine L-ornitina (500 mg/L) i dobro je pomiješati s 10 ml PDA hranjivog medija kako bi se pripremile otopine s konačnim koncentracijama od 12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/L. Pet koncentracija fungicida „Rizolex-T“ (2, 4, 6, 8 i 10 mg/L) i sterilna destilirana voda korišteni su kao kontrola. Nakon što se medij stvrdnuo, svježe pripremljeni micelijski čep kulture Sclerotinia sclerotiorum, promjera 4 mm, prenesen je u središte Petrijeve zdjelice i uzgajan na 25±2°C dok micelij nije prekrio cijelu kontrolnu Petrijevu zdjelicu, nakon čega je zabilježen rast gljivica. Izračunajte postotak inhibicije radijalnog rasta S. sclerotiorum koristeći jednadžbu 1:
Pokus je ponovljen dva puta, sa šest bioloških ponavljanja za svaku kontrolnu/eksperimentalnu skupinu i pet posuda (dvije biljke po posudi) za svako biološko ponavljanje. Svako biološko ponavljanje analizirano je dva puta (dva tehnička ponavljanja) kako bi se osigurala točnost, pouzdanost i ponovljivost eksperimentalnih rezultata. Osim toga, korištena je probit regresijska analiza za izračun polumaksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) i IC99 (Prentice, 1976).
Kako bi se procijenio potencijal L-ornitina u uvjetima staklenika, provedena su dva uzastopna pokusa u posudama. Ukratko, posude su napunjene steriliziranom glinovitim pijeskom (3:1) i inokulirane svježe pripremljenom kulturom S. sclerotiorum. Prvo je najinvazivniji izolat S. sclerotiorum (izolat #3) uzgajan prerezivanjem jednog sklerocija na pola, postavljanjem licem prema dolje na PDA i inkubacijom na 25°C u stalnom mraku (24 sata) tijekom 4 dana kako bi se stimulirao rast micelija. Zatim su s prednjeg ruba uzeta četiri agar čepa promjera 5 mm i inokulirana sa 100 g sterilne smjese pšeničnih i rižinih mekinja (1:1, v/v) te su sve tikvice inkubirane na 25 ± 2 °C u ciklusu od 12 sati svjetla/12 sati mraka tijekom 5 dana kako bi se stimuliralo stvaranje sklerocija. Sadržaj svih tikvica temeljito je promiješan kako bi se osigurala homogenost prije dodavanja tla. Zatim je u svaku posudu dodano 100 g smjese mekinja za kolonizaciju kako bi se osigurala konstantna koncentracija patogena. Inokulirane posude su zalijene kako bi se aktivirao rast gljivica i stavljene u stakleničke uvjete na 7 dana.
U svaku posudu posijano je pet sjemenki sorte Giza 3. Za posude tretirane L-ornitinom i fungicidom Rizolex-T, sterilizirano sjeme prvo je dva sata namakano u vodenoj otopini dvaju spojeva s konačnom koncentracijom IC99 od oko 250 mg/L odnosno 50 mg/L, a zatim sušeno na zraku jedan sat prije sjetve. S druge strane, sjeme je natopljeno u sterilnoj destiliranoj vodi kao negativna kontrola. Nakon 10 dana, prije prvog zalijevanja, sadnice su prorijeđene, ostavljajući samo dvije uredne sadnice u svakoj posudi. Osim toga, kako bi se osigurala infekcija s S. sclerotiorum, stabljike biljaka graha u istoj razvojnoj fazi (10 dana) prerezane su na dva različita mjesta steriliziranim skalpelom i u svaku ranu stavljeno je približno 0,5 g kolonizirajuće smjese mekinja, nakon čega je uslijedila visoka vlažnost zraka kako bi se potaknula infekcija i razvoj bolesti u svim inokuliranim biljkama. Kontrolne biljke su slično ozlijeđene i jednaka količina (0,5 g) sterilne, nekolonizirane smjese mekinja je stavljena u ranu i održavana pod visokom vlažnošću kako bi se simuliralo okruženje za razvoj bolesti i osigurala dosljednost između tretiranih skupina.
Metoda tretmana: Sadnice graha zalijevane su s 500 ml vodene otopine L-ornitina (250 mg/l) ili fungicida Rizolex-T (50 mg/l) navodnjavanjem tla, zatim je tretman ponovljen tri puta u razmaku od 10 dana. Kontrolne skupine tretirane placebom zalijevane su s 500 ml sterilne destilirane vode. Svi tretmani provedeni su u uvjetima staklenika (25 ± 2°C, 75 ± 1% relativne vlažnosti i fotoperiod od 8 sati svjetla/16 sati tame). Sve posude zalijevane su svaka dva tjedna i mjesečno tretirane uravnoteženim NPK gnojivom (20-20-20, s 3,6% sumpora i TE mikroelemenata; Zain Seeds, Egipat) u koncentraciji od 3–4 g/l folijarnim prskanjem prema preporukama za određenu sortu i uputama proizvođača. Osim ako nije drugačije navedeno, potpuno razvijeni zreli listovi (2. i 3. list od vrha) prikupljeni su iz svake biološke replike 72 sata nakon tretmana (hpt), homogenizirani, združeni i pohranjeni na -80 °C za daljnje analize, uključujući, ali ne ograničavajući se na, in situ histokemijsku lokalizaciju indikatora oksidativnog stresa, lipidnu peroksidaciju, enzimske i neenzimske antioksidanse i ekspresiju gena.
Intenzitet infekcije bijelom plijesni procijenjen je tjedno 21 dan nakon inokulacije (dpi) korištenjem skale od 1 do 9 (Dodatna tablica S2) na temelju Petzoldtove i Dicksonove skale (1996.) koju su modificirali Teran i sur. (2006.). Ukratko, stabljike i grane biljaka graha pregledane su počevši od mjesta inokulacije kako bi se pratilo napredovanje lezija duž internodija i čvorova. Zatim je izmjerena udaljenost lezije od mjesta inokulacije do najudaljenije točke duž stabljike ili grane i dodijeljen je rezultat od 1 do 9 na temelju lokacije lezije, gdje (1) označava da nema vidljive infekcije u blizini mjesta inokulacije, a (2-9) postupno povećanje veličine lezije i napredovanje duž čvorova/internodija (Dodatna tablica S2). Intenzitet infekcije bijelom plijesni zatim je pretvoren u postotak korištenjem formule 2:
Osim toga, površina ispod krivulje progresije bolesti (AUDPC) izračunata je pomoću formule (Shaner i Finney, 1977.), koja je nedavno prilagođena za bijelu trulež običnog graha (Chauhan i sur., 2020.) korištenjem jednadžbe 3:
Gdje je Yi = težina bolesti u vremenu ti, Yi+1 = težina bolesti u sljedećem vremenu ti+1, ti = vrijeme prvog mjerenja (u danima), ti+1 = vrijeme sljedećeg mjerenja (u danima), n = ukupan broj vremenskih točaka ili točaka promatranja. Parametri rasta biljke graha, uključujući visinu biljke (cm), broj grana po biljci i broj listova po biljci, bilježeni su tjedno tijekom 21 dana u svim biološkim ponavljanjima.
U svakoj biološkoj replikaciji, uzorci listova (drugi i treći potpuno razvijeni list od vrha) prikupljeni su 45. dana nakon tretmana (15 dana nakon posljednjeg tretmana). Svaka biološka replikacija sastojala se od pet posuda (dvije biljke po posudi). Oko 500 mg usitnjenog tkiva korišteno je za ekstrakciju fotosintetskih pigmenata (klorofil a, klorofil b i karotenoidi) korištenjem 80%-tnog acetona na 4 °C u mraku. Nakon 24 sata, uzorci su centrifugirani, a supernatant je sakupljen za kolorimetrijsko određivanje sadržaja klorofila a, klorofila b i karotenoida pomoću UV-160A spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japan) prema metodi (Lichtenthaler, 1987.) mjerenjem apsorbancije na tri različite valne duljine (A470, A646 i A663 nm). Konačno, sadržaj fotosintetskih pigmenata izračunat je korištenjem sljedećih formula 4–6 koje je opisao Lichtenthaler (1987.).
72 sata nakon tretmana (hpt), listovi (drugi i treći potpuno razvijeni list od vrha) prikupljeni su iz svake biološke replike za in situ histokemijsku lokalizaciju vodikovog peroksida (H2O2) i superoksidnog aniona (O2•−). Svaka biološka replika sastojala se od pet posuda (dvije biljke po posudi). Svaka biološka replika analizirana je u duplikatu (dva tehnička ponavljanja) kako bi se osigurala točnost, pouzdanost i ponovljivost metode. H2O2 i O2•− određeni su korištenjem 0,1% 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Njemačka) odnosno nitroplavog tetrazolija (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Njemačka), slijedeći metode koje su opisali Romero-Puertas i sur. (2004.) i Adam i sur. (1989.) s manjim izmjenama. Za histokemijsku lokalizaciju H2O2 in situ, listići su vakuumski infiltrirani s 0,1% DAB u 10 mM Tris puferu (pH 7,8) i zatim inkubirani na sobnoj temperaturi na svjetlu 60 minuta. Listići su izbijeljeni u 0,15% (v/v) TCA u 4:1 (v/v) etanolu:kloroformu (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egipat) i zatim izloženi svjetlu dok nisu potamnili. Slično tome, ventili su vakuumski infiltrirani s 10 mM kalij-fosfatnim puferom (pH 7,8) koji sadrži 0,1 w/v % HBT za histokemijsku lokalizaciju O2•− in situ. Listići su inkubirani na svjetlu na sobnoj temperaturi 20 minuta, zatim izbijeljeni kao gore, a zatim osvijetljeni dok se nisu pojavile tamnoplave/ljubičaste mrlje. Intenzitet rezultirajuće smeđe (kao indikator H2O2) ili plavo-ljubičaste (kao indikator O2•−) boje procijenjen je korištenjem Fiji verzije paketa za obradu slika ImageJ (http://fiji.sc; pristupljeno 7. ožujka 2024.).
Malondialdehid (MDA; kao marker lipidne peroksidacije) određen je prema metodi Du i Bramlage (1992.) s malim izmjenama. Listovi iz svake biološke replike (drugi i treći potpuno razvijeni list od vrha) prikupljeni su 72 sata nakon tretmana (hpt). Svaka biološka replika uključivala je pet posuda (dvije biljke po posudi). Svaka biološka replika analizirana je u duplikatu (dva tehnička ponavljanja) kako bi se osigurala točnost, pouzdanost i ponovljivost metode. Ukratko, 0,5 g mljevenog tkiva lista korišteno je za ekstrakciju MDA s 20% trikloroctenom kiselinom (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, SAD) koja sadrži 0,01% butiliranog hidroksitoluena (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). Sadržaj MDA u supernatantu zatim je kolorimetrijski određen mjerenjem apsorbancije na 532 i 600 nm pomoću UV-160A spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japan) i zatim izražen kao nmol g−1 FW.
Za procjenu neenzimskih i enzimskih antioksidansa, listovi (drugi i treći potpuno razvijeni list od vrha) prikupljeni su iz svake biološke replike 72 sata nakon tretmana (hpt). Svaka biološka replika sastojala se od pet posuda (dvije biljke po posudi). Svaki biološki uzorak analiziran je u duplikatu (dva tehnička uzorka). Dva lista su samljevena tekućim dušikom i izravno korištena za određivanje enzimskih i neenzimskih antioksidansa, ukupnih aminokiselina, sadržaja prolina, ekspresije gena i kvantifikacije oksalata.
Ukupni topljivi fenoli određeni su pomoću Folin-Ciocalteu reagensa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) s malim modifikacijama metode koju su opisali Kahkonen i suradnici (1999.). Ukratko, približno 0,1 g homogeniziranog tkiva lista ekstrahirano je s 20 ml 80%-tnog metanola u mraku tijekom 24 sata, a supernatant je sakupljen nakon centrifugiranja. 0,1 ml ekstrakta uzorka pomiješano je s 0,5 ml Folin-Ciocalteu reagensa (10%), protreseno 30 sekundi i ostavljeno u mraku 5 minuta. Zatim je u svaku epruvetu dodano 0,5 ml 20%-tne otopine natrijevog karbonata (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Egipat), dobro promiješano i inkubirano na sobnoj temperaturi u mraku tijekom 1 sata. Nakon inkubacije, apsorbancija reakcijske smjese izmjerena je na 765 nm pomoću UV-160A spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japan). Koncentracija ukupnih topljivih fenola u ekstraktima uzoraka određena je pomoću kalibracijske krivulje galne kiseline (Fisher Scientific, Hampton, NH, SAD) i izražena kao miligrami ekvivalenta galne kiseline po gramu svježe težine (mg GAE g-1 svježe težine).
Ukupni sadržaj topljivih flavonoida određen je prema metodi Djeridanea i suradnika (2006.) s malim izmjenama. Ukratko, 0,3 ml gore navedenog metanolnog ekstrakta pomiješano je s 0,3 ml 5%-tne otopine aluminijevog klorida (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, SAD), snažno miješano i zatim inkubirano na sobnoj temperaturi 5 minuta, nakon čega je dodano 0,3 ml 10%-tne otopine kalijevog acetata (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egipat), dobro promiješano i inkubirano na sobnoj temperaturi 30 minuta u mraku. Nakon inkubacije, apsorbancija reakcijske smjese izmjerena je na 430 nm pomoću UV-160A spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japan). Koncentracija ukupnih topljivih flavonoida u ekstraktima uzoraka određena je pomoću kalibracijske krivulje rutina (TCI America, Portland, OR, SAD), a zatim izražena kao miligrami ekvivalenta rutina po gramu svježe težine (mg RE g-1 svježe težine).
Ukupni sadržaj slobodnih aminokiselina u listovima graha određen je modificiranim ninhidrinskim reagensom (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SAD) na temelju metode koju su predložili Yokoyama i Hiramatsu (2003.) i modificirali Sun i sur. (2006.). Ukratko, 0,1 g mljevenog tkiva ekstrahirano je puferom pH 5,4, a 200 μL supernatanta reagiralo je s 200 μL ninhidrina (2%) i 200 μL piridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, SAD), inkubirano u kipućoj vodenoj kupelji 30 minuta, zatim ohlađeno i izmjereno na 580 nm pomoću UV-160A spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japan). S druge strane, prolin je određen Batesovom metodom (Bates i sur., 1973.). Prolin je ekstrahiran s 3%-tnom sulfosalicilnom kiselinom (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SAD) i nakon centrifugiranja, 0,5 ml supernatanta pomiješano je s 1 ml ledene octene kiseline (Fisher Scientific, Hampton, NH, SAD) i ninhidrinskim reagensom, inkubirano na 90°C tijekom 45 minuta, ohlađeno i izmjereno na 520 nm pomoću istog spektrofotometra kao gore. Ukupne slobodne aminokiseline i prolin u ekstraktima listova određeni su pomoću kalibracijskih krivulja glicina i prolina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SAD) i izraženi kao mg/g svježe težine.
Za određivanje enzimske aktivnosti antioksidativnih enzima, približno 500 mg homogeniziranog tkiva ekstrahirano je s 3 ml 50 mM Tris pufera (pH 7,8) koji sadrži 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i 7,5% polivinilpirolidona (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), centrifugirano pri 10 000 × g tijekom 20 minuta u hlađenju (4 °C), a supernatant (sirovi ekstrakt enzima) je sakupljen (El-Nagar i sur., 2023.; Osman i sur., 2023.). Katalaza (CAT) je zatim reagirala s 2 ml 0,1 M natrijevog fosfatnog pufera (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i 100 μl otopine H2O2 od 269 mM kako bi se odredila njezina enzimska aktivnost prema metodi Aebija (1984.) s malim modifikacijama (El-Nagar i sur., 2023.; Osman i sur., 2023.). Enzimska aktivnost gvajakol-ovisne peroksidaze (POX) određena je metodom Harracha i sur. (2009.). (2008.) s manjim izmjenama (El-Nagar i sur., 2023.; Osman i sur., 2023.) i enzimska aktivnost polifenol oksidaze (PPO) određena je nakon reakcije s 2,2 ml 100 mM natrijevog fosfatnog pufera (pH 6,0), 100 μl gvajakola (TCI chemicals, Portland, OR, SAD) i 100 μl 12 mM H2O2. Metoda je neznatno modificirana u odnosu na (El-Nagar i sur., 2023.; Osman i sur., 2023.). Ispitivanje je provedeno nakon reakcije s 3 ml otopine katehola (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SAD) (0,01 M) svježe pripremljene u 0,1 M fosfatnom puferu (pH 6,0). Aktivnost CAT mjerena je praćenjem razgradnje H2O2 na 240 nm (A240), aktivnost POX mjerena je praćenjem porasta apsorbancije na 436 nm (A436), a aktivnost PPO mjerena je bilježenjem fluktuacija apsorbancije na 495 nm (A495) svakih 30 s tijekom 3 minute pomoću UV-160A spektrofotometra (Shimadzu, Japan).
Za detekciju razina transkripata triju gena povezanih s antioksidansima, uključujući peroksisomsku katalazu (PvCAT1; GenBank pristupni broj KF033307.1), superoksid dismutazu (PvSOD; GenBank pristupni broj XM_068639556.1) i glutation reduktazu (PvGR; GenBank pristupni broj KY195009.1) u listovima graha (drugi i treći potpuno razvijeni list od vrha) 72 sata nakon posljednjeg tretmana, korištena je RT-PCR u stvarnom vremenu. Ukratko, RNA je izolirana pomoću Simply P Total RNA Extraction Kita (kat. br. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Kina) prema protokolu proizvođača. Zatim je cDNA sintetizirana pomoću TOP script™ cDNA Synthesis Kita prema uputama proizvođača. Sekvence primera za gore navedena tri gena navedene su u Dodatnoj tablici S3. PvActin-3 (pristupni broj GenBank: XM_068616709.1) korišten je kao gen za održavanje, a relativna ekspresija gena izračunata je korištenjem 2-ΔΔCT metode (Livak i Schmittgen, 2001.). Dokazana je stabilnost aktina pod biotičkim stresom (nekompatibilna interakcija između uobičajenih mahunarki i antraknozne gljive Colletotrichum lindemuthianum) i abiotičkim stresom (suša, salinitet, niska temperatura) (Borges i sur., 2012.).
U početku smo proveli in silico analizu cijelog genoma proteina oksaloacetat acetilhidrolaze (OAH) u S. sclerotiorum koristeći alat protein-protein BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul i sur., 1997., 2005.). Ukratko, koristili smo OAH iz Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksid: 1191702; pristupni broj GenBank XP_040799428.1; 342 aminokiseline) i Penicillium lagena (PlOAH; taksid: 94218; pristupni broj GenBank XP_056833920.1; 316 aminokiselina) kao upitne sekvence za mapiranje homolognog proteina u S. sclerotiorum (taksid: 5180). BLASTp je proveden na najnovijim dostupnim podacima genoma S. sclerotiorum u GenBank-u na web stranici Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Osim toga, predviđeni OAH gen iz S. sclerotiorum (SsOAH) te evolucijska analiza i filogenetsko stablo AfOAH iz A. fijiensis CBS 313.89 i PlOAH iz P. lagena izvedeni su korištenjem metode maksimalne vjerojatnosti u MEGA11 (Tamura i sur., 2021.) i JTT modela temeljenog na matrici (Jones i sur., 1992.). Filogenetsko stablo kombinirano je s analizom višestrukog poravnanja proteinskih sekvenci svih predviđenih OAH gena (SsOAH) iz S. sclerotiorum i upitnog slijeda korištenjem alata za poravnanje temeljeno na ograničenjima (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos i Agarwala, 2007.). Osim toga, najbolje podudarne aminokiselinske sekvence SsOAH iz S. sclerotiorum usklađene su s upitnim sekvencama (AfOAH i PlOAH) (Larkin i sur., 2007.) korištenjem ClustalW-a (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), a konzervirane regije u poravnanju vizualizirane su korištenjem alata ESPript (verzija 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Nadalje, predviđene funkcionalne reprezentativne domene i konzervirana mjesta S. sclerotiorum SsOAH interaktivno su klasificirane u različite porodice pomoću alata InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum i sur., 2021.). Konačno, trodimenzionalno (3D) modeliranje strukture predviđenog S. sclerotiorum SsOAH provedeno je pomoću Protein Homology/Analogy Recognition Engine-a (Phyre2 poslužitelj verzija 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley i sur., 2015.) i validirano pomoću SWISS-MODEL poslužitelja (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini i sur., 2014.). Predviđene trodimenzionalne strukture (PDB format) interaktivno su vizualizirane korištenjem UCSF-Chimera paketa (verzija 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen i sur., 2004.).
Kvantitativna PCR fluorescencije u stvarnom vremenu korištena je za određivanje transkripcijske razine oksaloacetat acetilhidrolaze (SsOAH; pristupni broj GenBank: XM_001590428.1) u miceliju Sclerotinia sclerotiorum. Ukratko, S. sclerotiorum je inokuliran u tikvicu koja sadrži PDB i stavljen u inkubator na tresilici (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, SAD) na 25 ± 2 °C tijekom 24 sata pri 150 okretaja u minuti i u stalnom mraku (24 sata) kako bi se stimulirao rast micelija. Nakon toga, stanice su tretirane L-ornitinom i fungicidom Rizolex-T u konačnim koncentracijama IC50 (približno 40 i 3,2 mg/L) te zatim kultivirane još 24 sata pod istim uvjetima. Nakon inkubacije, kulture su centrifugirane pri 2500 okretaja u minuti tijekom 5 minuta, a supernatant (gljivični micelij) je prikupljen za analizu ekspresije gena. Slično tome, gljivični micelij je prikupljen 0, 24, 48, 72, 96 i 120 sati nakon infekcije iz zaraženih biljaka koje su formirale bijelu plijesan i pamučni micelij na površini zaraženog tkiva. RNA je ekstrahirana iz gljivičnog micelija, a zatim je cDNA sintetizirana kako je gore opisano. Sekvence primera za SsOAH navedene su u Dodatnoj tablici S3. SsActin (GenBank pristupni broj: XM_001589919.1) korišten je kao gen za održavanje, a relativna ekspresija gena izračunata je pomoću 2-ΔΔCT metode (Livak i Schmittgen, 2001).
Oksalna kiselina određena je u krumpirovom dekstroznom temeljcu (PDB) i uzorcima biljaka koji sadrže gljivični patogen Sclerotinia sclerotiorum prema metodi Xu i Zhang (2000.) s malim izmjenama. Ukratko, izolati S. sclerotiorum inokulirani su u tikvice koje sadrže PDB, a zatim uzgajani u inkubatoru na tresilici (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, SAD) pri 150 okretaja u minuti na 25 ± 2 °C tijekom 3-5 dana u stalnom mraku (24 sata) kako bi se potaknuo rast micelija. Nakon inkubacije, gljivična kultura je prvo filtrirana kroz Whatman #1 filter papir, a zatim centrifugirana pri 2500 okretaja u minuti tijekom 5 minuta kako bi se uklonio preostali micelij. Supernatant je sakupljen i pohranjen na 4 °C za daljnje kvantitativno određivanje oksalata. Za pripremu uzoraka biljaka, približno 0,1 g fragmenata biljnog tkiva ekstrahirano je tri puta destiliranom vodom (2 ml svaki put). Uzorci su zatim centrifugirani pri 2500 okretaja u minuti tijekom 5 minuta, supernatant je suho filtriran kroz Whatman br. 1 filter papir i sakupljen za daljnju analizu.
Za kvantitativnu analizu oksalne kiseline, reakcijska smjesa je pripremljena u staklenoj epruveti sa čepom sljedećim redoslijedom: 0,2 ml uzorka (ili filtrata PDB kulture ili standardne otopine oksalne kiseline), 0,11 ml bromofenol plavog (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, SAD), 0,198 ml 1 M sumporne kiseline (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egipat) i 0,176 ml 100 mM kalijevog dikromata (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, SAD), a zatim je otopina razrijeđena destiliranom vodom na 4,8 ml, snažno promiješana i odmah stavljena u vodenu kupelj na 60 °C. Nakon 10 minuta, reakcija je zaustavljena dodavanjem 0,5 ml otopine natrijevog hidroksida (NaOH; 0,75 M). Apsorbancija (A600) reakcijske smjese mjerena je na 600 nm pomoću UV-160 spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japan). PDB i destilirana voda korišteni su kao kontrole za kvantifikaciju filtrata kulture, odnosno uzoraka biljaka. Koncentracije oksalne kiseline u filtratima kulture, izražene kao mikrogrami oksalne kiseline po mililitru PDB medija (μg.mL−1), i u ekstraktima listova, izražene kao mikrogrami oksalne kiseline po gramu svježe težine (μg.g−1 FW), određene su pomoću kalibracijske krivulje oksalne kiseline (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, SAD).
Tijekom istraživanja, svi eksperimenti su osmišljeni prema potpuno randomiziranom dizajnu (CRD) sa šest bioloških replika po tretmanu i pet posuda po biološkoj repliki (dvije biljke po posudi), osim ako nije drugačije navedeno. Biološke replike su analizirane u duplikatu (dvije tehničke replike). Tehničke replike su korištene za provjeru ponovljivosti istog eksperimenta, ali nisu korištene u statističkoj analizi kako bi se izbjegli lažni replikati. Podaci su statistički analizirani korištenjem analize varijance (ANOVA), nakon čega je slijedio Tukey-Kramerov test značajne razlike (HSD) (p ≤ 0,05). Za in vitro eksperimente, vrijednosti IC50 i IC99 izračunate su korištenjem probit modela i izračunati su 95% intervali pouzdanosti.
Ukupno četiri izolata prikupljena su s različitih polja soje u governoratu El Ghabiya u Egiptu. Na PDA mediju, svi izolati su proizveli kremasto bijeli micelij koji je brzo postao pamučasto bijel (Slika 1A), a zatim bež ili smeđ u fazi sklerocija. Sklerocije su obično guste, crne, sfernog ili nepravilnog oblika, duge 5,2 do 7,7 mm i promjera 3,4 do 5,3 mm (Slika 1B). Iako su četiri izolata razvila rubni uzorak sklerocija na rubu hranjive podloge nakon 10-12 dana inkubacije na 25 ± 2 °C (Slika 1A), broj sklerocija po ploči bio je značajno različit među njima (P < 0,001), pri čemu je izolat 3 imao najveći broj sklerocija (32,33 ± 1,53 sklerocija po ploči; Slika 1C). Slično tome, izolat #3 je u PDB-u proizveo više oksalne kiseline nego drugi izolati (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; slika 1D). Izolat #3 pokazao je tipične morfološke i mikroskopske karakteristike fitopatogene gljivice Sclerotinia sclerotiorum. Na primjer, na PDA, kolonije izolata #3 su brzo rasle, bile su kremasto bijele (slika 1A), obrnuto bež ili svijetlo losos žuto-smeđe boje, te im je trebalo 6-7 dana na 25 ± 2°C da potpuno prekriju površinu ploče promjera 9 cm. Na temelju gore navedenih morfoloških i mikroskopskih karakteristika, izolat #3 je identificiran kao Sclerotinia sclerotiorum.
Slika 1. Karakteristike i patogenost izolata S. sclerotiorum s uobičajenih mahunarki. (A) Rast micelija četiri izolata S. sclerotiorum na PDA mediju, (B) sklerocije četiri izolata S. sclerotiorum, (C) broj sklerocija (po ploči), (D) lučenje oksalne kiseline na PDB mediju (μg.mL−1) i (E) težina bolesti (%) četiri izolata S. sclerotiorum na osjetljivoj komercijalnoj mahunarki sorti Giza 3 u uvjetima staklenika. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± SD pet bioloških ponavljanja (n = 5). Različita slova označavaju statistički značajne razlike između tretmana (p < 0,05). (F–H) Tipični simptomi bijele plijesni pojavili su se na nadzemnim stabljikama i silicima 10 dana nakon inokulacije izolatom #3 (dpi). (I) Evolucijska analiza regije internog transkribiranog razmaknika (ITS) izolata S. sclerotiorum #3 provedena je korištenjem metode maksimalne vjerojatnosti i uspoređena s 20 referentnih izolata/sojeva dobivenih iz baze podataka Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Brojevi iznad linija grupiranja označavaju pokrivenost regije (%), a brojevi ispod linija grupiranja označavaju duljinu grane.
Nadalje, kako bi se potvrdila patogenost, četiri dobivena izolata S. sclerotiorum korištena su za inokulaciju osjetljivog komercijalnog kultivara graha Giza 3 u uvjetima staklenika, što je u skladu s Kochovim postulatima (slika 1E). Iako su svi dobiveni gljivični izolati bili patogeni i mogli su zaraziti zeleni grah (sorta Giza 3), uzrokujući tipične simptome bijele plijesni na svim nadzemnim dijelovima (slika 1F), posebno na stabljikama (slika 1G) i mahunama (slika 1H) 10 dana nakon inokulacije (dpi), izolat 3 bio je najagresivniji izolat u dva neovisna eksperimenta. Izolat 3 imao je najveću težinu bolesti (%) na biljkama graha (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 i 76,7 ± 3,1 7, 14 i 21 dan nakon infekcije; slika 1F).
Identifikacija najinvazivnijeg izolata S. sclerotiorum #3 dodatno je potvrđena na temelju internog transkribiranog razmaknika (ITS) sekvenciranja (slika 1I). Filogenetska analiza između izolata #3 i 20 referentnih izolata/sojeva pokazala je visoku sličnost (>99%) među njima. Vrijedi napomenuti da izolat S. sclerotiorum #3 (533 bp) ima visoku sličnost s američkim izolatom S. sclerotiorum LPM36 izoliranim iz suhog sjemena graška (GenBank pristupni broj MK896659.1; 540 bp) i kineskim izolatom S. sclerotiorum YKY211 (GenBank pristupni broj OR206374.1; 548 bp), koji uzrokuje trulež stabljike ljubičice (Matthiola incana), a svi su odvojeno grupirani na vrhu dendrograma (slika 1I). Novi slijed je pohranjen u NCBI bazu podataka i nazvan „Sclerotinia sclerotiorum – izolat YN-25“ (GenBank pristupni broj PV202792). Može se vidjeti da je izolat 3 najinvazivniji izolat; stoga je ovaj izolat odabran za proučavanje u svim sljedećim eksperimentima.
Antibakterijska aktivnost diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Njemačka) pri različitim koncentracijama (12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/L) protiv izolata 3 S. sclerotiorum istražena je in vitro. Vrijedno je napomenuti da je L-ornitin pokazao antibakterijski učinak i postupno inhibirao radijalni rast hifa S. sclerotiorum na način ovisan o dozi (Slika 2A, B). Pri najvišoj testiranoj koncentraciji (125 mg/L), L-ornitin je pokazao najveću stopu inhibicije rasta micelija (99,62 ± 0,27%; Slika 2B), što je bilo ekvivalentno komercijalnom fungicidu Rizolex-T (stopa inhibicije 99,45 ± 0,39%; Slika 2C) pri najvišoj testiranoj koncentraciji (10 mg/L), što ukazuje na sličnu učinkovitost.
Slika 2. In vitro antibakterijska aktivnost L-ornitina protiv Sclerotinia sclerotiorum. (A) Usporedba antibakterijske aktivnosti različitih koncentracija L-ornitina protiv S. sclerotiorum s komercijalnim fungicidom Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Stopa inhibicije (%) rasta micelija S. sclerotiorum nakon tretmana s različitim koncentracijama L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/L) odnosno Rizolex-T (2, 4, 6, 8 i 10 mg/L). Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± SD pet bioloških ponavljanja (n = 5). Različita slova označavaju statističke razlike između tretmana (p < 0,05). (D, E) Regresijska analiza probit modela L-ornitina i komercijalnog fungicida Rizolex-T. Regresijska linija probit modela prikazana je kao puna plava linija, a interval pouzdanosti (95%) prikazan je kao isprekidana crvena linija.
Osim toga, provedena je probit regresijska analiza, a odgovarajući grafovi prikazani su u Tablici 1 i Slikama 2D,E. Ukratko, prihvatljiva vrijednost nagiba (y = 2,92x − 4,67) i pridružena značajna statistika (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 i p < 0,0001; Slika 2D) L-ornitina ukazivale su na pojačanu antifungalnu aktivnost protiv S. sclerotiorum u usporedbi s komercijalnim fungicidom Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 i p < 0,0001) (Tablica 1).
Tablica 1. Vrijednosti polovine maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) i IC99 (mg/l) L-ornitina i komercijalnog fungicida „Rizolex-T“ protiv S. sclerotiorum.
Sveukupno, L-ornitin (250 mg/L) značajno je smanjio razvoj i težinu bijele plijesni na tretiranim biljkama običnog graha u usporedbi s netretiranim biljkama zaraženim S. sclerotiorum (kontrola; Slika 3A). Ukratko, iako se težina bolesti netretiranih zaraženih kontrolnih biljaka postupno povećavala (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 i 92,33 ± 3,06%), L-ornitin je značajno smanjio težinu bolesti (%) tijekom cijelog eksperimenta (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 i 26,36 ± 3,07) 7, 14 i 21 dan nakon tretmana (dpt) (Slika 3A). Slično tome, kada su biljke graha zaražene S. sclerotiorum tretirane s 250 mg/L L-ornitina, površina ispod krivulje progresije bolesti (AUDPC) smanjila se s 1274,33 ± 33,13 u netretiranoj kontroli na 281,03 ± 7,95, što je bilo nešto niže od površine pozitivne kontrole fungicidom Rizolex-T od 50 mg/L (183,61 ± 7,71; slika 3B). Isti trend uočen je u drugom pokusu.
Sl. 3. Učinak egzogene primjene L-ornitina na razvoj bijele truleži običnog graha uzrokovane Sclerotinia sclerotiorum u uvjetima staklenika. (A) Krivulja progresije bolesti bijele plijesni običnog graha nakon tretmana s 250 mg/L L-ornitina. (B) Površina ispod krivulje progresije bolesti (AUDPC) bijele plijesni običnog graha nakon tretmana s L-ornitinom. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± SD pet bioloških ponavljanja (n = 5). Različita slova označavaju statistički značajne razlike između tretmana (p < 0,05).
Egzogena primjena 250 mg/L L-ornitina postupno je povećavala visinu biljke (slika 4A), broj grana po biljci (slika 4B) i broj listova po biljci (slika 4C) nakon 42 dana. Dok je komercijalni fungicid Rizolex-T (50 mg/L) imao najveći učinak na sve proučavane nutritivne parametre, egzogena primjena 250 mg/L L-ornitina imala je drugi najveći učinak u usporedbi s netretiranim kontrolama (slike 4A–C). S druge strane, tretman L-ornitinom nije imao značajan učinak na sadržaj fotosintetskih pigmenata klorofila a (slika 4D) i klorofila b (slika 4E), ali je neznatno povećao ukupni sadržaj karotenoida (0,56 ± 0,03 mg/g svježe težine) u usporedbi s negativnom kontrolom (0,44 ± 0,02 mg/g svježe težine) i pozitivnom kontrolom (0,46 ± 0,02 mg/g svježe težine; slika 4F). Sveukupno, ovi rezultati pokazuju da L-ornitin nije fitotoksičan za tretirane mahunarke, te čak može stimulirati njihov rast.
Sl. 4. Učinak primjene egzogenog L-ornitina na karakteristike rasta i fotosintetske pigmente listova graha zaraženih sa Sclerotinia sclerotiorum u uvjetima staklenika. (A) Visina biljke (cm), (B) Broj grana po biljci, (C) Broj listova po biljci, (D) Sadržaj klorofila a (mg g-1 svježe težine), (E) Sadržaj klorofila b (mg g-1 svježe težine), (F) Ukupni sadržaj karotenoida (mg g-1 svježe težine). Vrijednosti su srednja vrijednost ± SD pet bioloških ponavljanja (n = 5). Različita slova označavaju statistički značajne razlike između tretmana (p < 0,05).
In situ histokemijska lokalizacija reaktivnih kisikovih vrsta (ROS; izraženo kao vodikov peroksid [H2O2]) i slobodnih radikala (izraženih kao superoksidni anioni [O2•−]) otkrila je da egzogena primjena L-ornitina (250 mg/L) značajno smanjuje akumulaciju H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; slika 5A) i O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; slika 5B) u usporedbi s akumulacijom i netretiranih zaraženih biljaka (173,31 ± 12,06 odnosno 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) i biljaka tretiranih s 50 mg/L komercijalnog fungicida Rizolex-T (170,12 ± 9,50 odnosno 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) nakon 72 sata. Visoke razine H2O2 i O2•− akumulirale su se pod visokim tlakom (slika 5A, B). Slično tome, test malondialdehida (MDA) na bazi TCA pokazao je da su biljke graha zaražene S. sclerotiorum akumulirale veće razine MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr. wt) u svojim listovima (slika 5C). Međutim, egzogena primjena L-ornitina značajno je smanjila lipidnu peroksidaciju, što je dokazano smanjenjem sadržaja MDA u tretiranim biljkama (33,08 ± 4,00 nmol.g fr. wt).
Sl. 5. Učinak primjene egzogenog L-ornitina na glavne markere oksidativnog stresa i neenzimske mehanizme antioksidativne obrane u listovima graha zaraženim s S. sclerotiorum 72 sata nakon infekcije u uvjetima staklenika. (A) Vodikov peroksid (H2O2; nmol g−1 FW) pri 72 hpt, (B) superoksidni anion (O2•−; nmol g−1 FW) pri 72 hpt, (C) malondialdehid (MDA; nmol g−1 FW) pri 72 hpt, (D) ukupni topljivi fenoli (mg GAE g−1 FW) pri 72 hpt, (E) ukupni topljivi flavonoidi (mg RE g−1 FW) pri 72 hpt, (F) ukupne slobodne aminokiseline (mg g−1 FW) pri 72 hpt i (G) sadržaj prolina (mg g−1 FW) pri 72 hpt. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju (srednja vrijednost ± SD) 5 bioloških ponavljanja (n = 5). Različita slova označavaju statistički značajne razlike između tretmana (p < 0,05).