Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Nanočestice inzulina (NP) s visokim udjelom punjenja pronašle su različite primjene u različitim oblicima doziranja. Cilj ovog rada je procijeniti učinak procesa liofilizacije i sušenja raspršivanjem na strukturu nanočestica hitosana opterećenih inzulinom, sa ili bez manitola kao krioprotektanta. Također smo procijenili kvalitetu ovih nanočestica njihovim ponovnim otapanjem. Prije dehidracije, veličina čestica umreženih nanočestica hitosana/natrijevog tripolifosfata/inzulina optimizirana je na 318 nm, PDI je bio 0,18, učinkovitost enkapsulacije 99,4%, a punjenje 25,01%. Nakon rekonstitucije, sve nanočestice, osim onih proizvedenih metodom liofilizacije bez upotrebe manitola, zadržale su svoju sferičnu strukturu čestica. U usporedbi s nanočesticama koje sadrže manitol dehidriranim bilo kojim raspršivanjem, nanočestice sušene raspršivanjem bez manitola također su pokazale najmanju prosječnu veličinu čestica (376 nm) i najveći udio punjenja (25,02%) sa sličnom stopom enkapsulacije (98,7%) i PDI. (0,20) tehnikama sušenja ili liofilizacije. Osušene nanočestice sušenjem raspršivanjem bez manitola također su rezultirale najbržim oslobađanjem inzulina i najvećom učinkovitošću stanične apsorpcije. Ovaj rad pokazuje da sušenje raspršivanjem može dehidrirati nanočestice inzulina bez potrebe za krioprotektantima u usporedbi s konvencionalnim metodama liofilizacije, stvarajući veći kapacitet punjenja, niže potrebe za aditivima i značajnu prednost u operativnim troškovima.
Od svog otkrića 1922. godine1,2,3, inzulin i njegovi farmaceutski pripravci spasili su živote pacijenata s dijabetesom tipa 1 (T1DM) i dijabetesom tipa 2 (T1DM). Međutim, zbog svojih svojstava proteina visoke molekularne težine, inzulin se lako agregira, razgrađuje proteolitičkim enzimima i eliminira učinkom prvog prolaska. Osobe s dijagnozom dijabetesa tipa 1 trebaju injekcije inzulina do kraja života. Mnogi pacijenti kojima je u početku dijagnosticiran dijabetes tipa 2 također trebaju dugotrajne injekcije inzulina. Dnevne injekcije inzulina ozbiljan su izvor svakodnevne boli i nelagode za te osobe, s negativnim učincima na mentalno zdravlje. Kao rezultat toga, drugi oblici primjene inzulina koji uzrokuju manje nelagode, poput oralne primjene inzulina, opsežno se proučavaju5 jer imaju potencijal vratiti kvalitetu života otprilike 5 milijardi ljudi s dijabetesom diljem svijeta.
Tehnologija nanočestica omogućila je značajan napredak u pokušajima uzimanja oralnog inzulina4,6,7. Inzulin učinkovito enkapsulira i štiti inzulin od degradacije za ciljanu dostavu na specifična mjesta u tijelu. Međutim, upotreba formulacija s nanočesticama ima nekoliko ograničenja, uglavnom zbog problema sa stabilnošću suspenzija čestica. Tijekom skladištenja može doći do određene agregacije, što smanjuje bioraspoloživost nanočestica opterećenih inzulinom8. Osim toga, kemijska stabilnost polimerne matrice nanočestica i inzulina također se mora uzeti u obzir kako bi se osigurala stabilnost nanočestica inzulina (NP). Trenutno je tehnologija liofilizacije zlatni standard za stvaranje stabilnih NP, a istovremeno sprječava neželjene promjene tijekom skladištenja9.
Međutim, liofilizacija zahtijeva dodavanje krioprotektanata kako bi se spriječilo da sferična struktura NP bude pod utjecajem mehaničkog naprezanja kristala leda. To značajno smanjuje opterećenje inzulinskim nanočesticama nakon liofilizacije, jer krioprotektant zauzima većinu težinskog omjera. Stoga se proizvedene inzulinske NP često smatraju neprikladnima za proizvodnju suhih praškastih formulacija, poput oralnih tableta i oralnih filmova, zbog potrebe za velikim količinama suhih nanočestica za postizanje terapijskog prozora inzulina.
Sušenje raspršivanjem je dobro poznati i jeftin postupak industrijske proizvodnje suhih prašaka iz tekućih faza u farmaceutskoj industriji10,11. Kontrola nad procesom stvaranja čestica omogućuje pravilnu enkapsulaciju nekoliko bioaktivnih spojeva12, 13. Nadalje, postala je učinkovita tehnika za pripremu enkapsuliranih proteina za oralnu primjenu. Tijekom sušenja raspršivanjem, voda vrlo brzo isparava, što pomaže u održavanju niske temperature jezgre čestice11,14, omogućujući njezinu primjenu za enkapsulaciju komponenti osjetljivih na toplinu. Prije sušenja raspršivanjem, materijal za premazivanje treba temeljito homogenizirati s otopinom koja sadrži enkapsulirane sastojke11,14. Za razliku od sušenja liofilizacijom, homogenizacija prije enkapsulacije u sušenju raspršivanjem poboljšava učinkovitost enkapsulacije tijekom dehidracije. Budući da proces enkapsulacije sušenjem raspršivanjem ne zahtijeva krioprotektante, sušenje raspršivanjem može se koristiti za proizvodnju osušenih NP s visokim udjelom punjenja.
Ova studija izvještava o proizvodnji NP-ova opterećenih inzulinom umrežavanjem hitosana i natrijevog tripolifosfata korištenjem metode ionskog gela. Ionska gelacija je metoda pripreme koja omogućuje proizvodnju nanočestica elektrostatskim interakcijama između dvije ili više ionskih vrsta pod određenim uvjetima. Za dehidraciju optimiziranih umreženih nanočestica hitosana/natrijevog tripolifosfata/inzulina korištene su tehnike liofilizacije i sušenja raspršivanjem. Nakon dehidracije, njihova morfologija analizirana je SEM-om. Njihova sposobnost rekombinacije procijenjena je mjerenjem raspodjele veličine, površinskog naboja, PDI-ja, učinkovitosti enkapsulacije i sadržaja punjenja. Kvaliteta resolubiliziranih nanočestica proizvedenih različitim metodama dehidracije također je procijenjena usporedbom njihove zaštite od inzulina, ponašanja oslobađanja i učinkovitosti staničnog upijanja.
pH miješane otopine i omjer hitosana i inzulina dva su ključna čimbenika koji utječu na veličinu čestica i učinkovitost enkapsulacije (EE) konačnih NP-ova, jer izravno utječu na ionotropni proces geliranja. Pokazalo se da je pH miješane otopine u visokoj korelaciji s veličinom čestica i učinkovitošću enkapsulacije (slika 1a). Kao što je prikazano na slici 1a, kako se pH povećavao s 4,0 na 6,0, prosječna veličina čestica (nm) se smanjivala, a EE se značajno povećavao, dok se kada se pH povećao na 6,5, prosječna veličina čestica počela povećavati, a EE je ostao nepromijenjen. Kako se omjer hitosana i inzulina povećava, povećava se i prosječna veličina čestica. Nadalje, nije uočena promjena EE kada su nanočestice pripremljene s masenim omjerom hitosana/inzulina većim od 2,5:1 (w/w) (slika 1b). Stoga su optimalni uvjeti pripreme u ovoj studiji (pH 6,0, maseni omjer hitosana/inzulina 2,5:1) korišteni za pripremu. nanočestice opterećene inzulinom za daljnje proučavanje. Pod ovim uvjetima pripreme, prosječna veličina čestica nanočestica inzulina optimizirana je na 318 nm (slika 1c), PDI je bio 0,18, učinkovitost ugradnje 99,4%, zeta potencijal 9,8 mv, a punjenje inzulinom 25,01% (m/m). Na temelju rezultata transmisijske elektronske mikroskopije (TEM), optimizirane nanočestice bile su otprilike sferne i diskretne s relativno ujednačenom veličinom (slika 1d).
Optimizacija parametara inzulinskih nanočestica: (a) utjecaj pH na srednji promjer i učinkovitost enkapsulacije (EE) inzulinskih nanočestica (pripremljenih pri masenom omjeru kitozana i inzulina 5:1); (b) kitozan i utjecaj masenog omjera inzulina na srednji promjer i učinkovitost enkapsulacije (EE) inzulinskih NP (pripremljenih pri pH 6); (c) raspodjela veličine čestica optimiziranih inzulinskih nanočestica; (d) TEM mikrografija optimiziranih inzulinskih NP.
Dobro je poznato da je hitosan slab polielektrolit s pKa od 6,5. Pozitivno je nabijen u kiselim medijima jer je njegova glavna amino skupina protonirana vodikovim ionima15. Stoga se često koristi kao nosač za enkapsulaciju negativno nabijenih makromolekula. U ovoj studiji, hitosan je korišten za enkapsulaciju inzulina s izoelektričnom točkom od 5,3. Budući da se hitosan koristi kao materijal za premaz, s povećanjem njegovog udjela, debljina vanjskog sloja nanočestica se odgovarajuće povećava, što rezultira većom prosječnom veličinom čestica. Osim toga, veće razine hitosana mogu enkapsulirati više inzulina. U našem slučaju, EE je bio najviši kada je omjer hitosana i inzulina dosegao 2,5:1, a nije bilo značajne promjene u EE kada se omjer nastavio povećavati.
Osim omjera kitozana i inzulina, pH je također igrao ključnu ulogu u pripremi NP-ova. Gan i suradnici 17 proučavali su utjecaj pH-a na veličinu čestica kitozanskih nanočestica. Otkrili su kontinuirano smanjenje veličine čestica sve dok pH nije dosegao 6,0, a značajno povećanje veličine čestica uočeno je pri pH > 6,0, što je u skladu s našim opažanjima. Ovaj fenomen je posljedica činjenice da s povećanjem pH-a molekula inzulina dobiva negativni površinski naboj, što pogoduje elektrostatskim interakcijama s kompleksom kitozana/natrijevog tripolifosfata (TPP), što rezultira malom veličinom čestica i visokom EE. Međutim, kada je pH podešen na 6,5, amino skupine na kitozanu su deprotonirane, što je rezultiralo savijanjem kitozana. Dakle, visoki pH rezultira manjom izloženošću amino iona TPP-u i inzulinu, što rezultira nižim umrežavanjem, većom konačnom prosječnom veličinom čestica i nižom EE.
Analiza morfoloških svojstava liofiliziranih i raspršivanjem sušenih NP može voditi odabir boljih tehnika dehidracije i formiranja praha. Poželjna metoda trebala bi osigurati stabilnost lijeka, ujednačen oblik čestica, visoku količinu lijeka i dobru topljivost u izvornoj otopini. U ovoj studiji, radi bolje usporedbe dviju tehnika, tijekom dehidracije korištene su inzulinske NP sa ili bez 1% manitola. Manitol se koristi kao sredstvo za povećanje volumena ili krioprotektant u raznim formulacijama suhog praha za liofilizaciju i sušenje raspršivanjem. Kod liofiliziranih inzulinskih nanočestica bez manitola, kao što je prikazano na slici 2a, pod skenirajućom elektronskom mikroskopijom (SEM) uočena je vrlo porozna struktura praha s velikim, nepravilnim i hrapavim površinama. Nakon dehidracije u prahu je otkriveno nekoliko diskretnih čestica (slika 2e). Ovi rezultati ukazuju na to da se većina NP razgradila tijekom liofilizacije bez ikakvog krioprotektanta. Kod liofiliziranih i raspršivanjem sušenih inzulinskih nanočestica koje sadrže 1% manitola uočene su sferne nanočestice s glatkim površinama (slika 2b, d, f, h). Inzulinske nanočestice sušene raspršivanjem bez manitola ostale su sferne, ali... naborane na površini (slika 2c). Sferne i naborane površine detaljnije su opisane u testovima ponašanja pri oslobađanju i staničnog upijanja u nastavku. Na temelju vidljivog izgleda osušenih NP, i NP sušene raspršivanjem bez manitola i NP liofilizirane i sušene raspršivanjem s manitolom dale su fine prahove NP (slika 2f,g,h). Što je veća površina između površina čestica, to je veća topljivost i stoga veća brzina oslobađanja.
Morfologija različitih dehidriranih NP inzulina: (a) SEM slika liofiliziranih NP inzulina bez manitola; (b) SEM slika liofiliziranih NP inzulina s manitolom; (c) raspršivanjem sušene NP inzulina bez manitola; SEM slika; (d) SEM slika raspršivanjem sušenih NP inzulina s manitolom; (e) slika liofiliziranog praha NP inzulina bez manitola; (f) slika liofiliziranih NP inzulina s manitolom; (g) Slika raspršivanjem sušenog praha NP inzulina bez manitola; (h) slika raspršivanjem sušenog praha NP inzulina s manitolom.
Tijekom liofilizacije, manitol djeluje kao krioprotektant, održavajući NP u amorfnom obliku i sprječavajući oštećenje kristalima leda19. Nasuprot tome, tijekom sušenja raspršivanjem nema koraka zamrzavanja. Stoga manitol nije potreban u ovoj metodi. Zapravo, sušene raspršivanjem NP bez manitola dale su finije NP kao što je prethodno opisano. Međutim, manitol i dalje može djelovati kao punilo u procesu sušenja raspršivanjem kako bi NP dobile sferniju strukturu20 (slika 2d), što pomaže u postizanju ujednačenog ponašanja oslobađanja takvih enkapsuliranih NP. Osim toga, jasno je da se neke velike čestice mogu otkriti i u liofiliziranim i u sušenim raspršivanjem NP inzulina koje sadrže manitol (slika 2b,d), što može biti posljedica nakupljanja manitola u jezgri čestice zajedno s enkapsuliranim inzulinom. Sloj kitozana. Vrijedi napomenuti da je u ovoj studiji, kako bi se osiguralo da sferična struktura ostane netaknuta nakon dehidracije, omjer manitola i kitozana održavan na 5:1, tako da velika količina punila također može povećati veličinu čestica osušenih NP-ova.
Spektroskopija Fourierove transformacije infracrvenog atenuiranog potpunog odraza (FTIR-ATR) karakterizirala je fizičku smjesu slobodnog inzulina, kitozana, kitozana, TPP-a i inzulina. Sve dehidrirane NP-e karakterizirane su korištenjem FTIR-ATR spektroskopije. Značajno je da su intenziteti vrpci od 1641, 1543 i 1412 cm-1 uočeni u enkapsuliranim NP-ima liofiliziranim s manitolom i u NP-ima sušenim raspršivanjem sa i bez manitola (slika 3). Kao što je prethodno objavljeno, ova povećanja čvrstoće povezana su s umrežavanjem između kitozana, TPP-a i inzulina. Istraživanje interakcije između kitozana i inzulina pokazalo je da se u FTIR spektrima nanočestica kitozana opterećenih inzulinom, vrpca kitozana preklapa s vrpcom inzulina, povećavajući intenzitet karbonilne (1641 cm-1) i aminske (1543 cm-1) vrpce. Tripolifosfatne skupine TPP-a povezane su s amonijevim skupinama u kitozanu, tvoreći vrpcu na 1412 cm-1.
FTIR-ATR spektri slobodnog inzulina, kitozana, fizičkih smjesa kitozana/TPP/inzulina i NP-ova dehidriranih različitim metodama.
Nadalje, ovi rezultati su u skladu s onima prikazanim u SEM-u, koji je pokazao da su enkapsulirane NP ostale netaknute i kada su raspršene i liofilizirane s manitolom, ali u odsutnosti manitola, samo sušenje raspršivanjem proizvelo je enkapsulirane čestice. Nasuprot tome, FTIR-ATR spektralni rezultati NP liofiliziranih bez manitola bili su vrlo slični fizičkoj smjesi hitosana, TPP-a i inzulina. Ovaj rezultat ukazuje na to da unakrsne veze između hitosana, TPP-a i inzulina više nisu prisutne u NP liofiliziranim bez manitola. Struktura NP je uništena tijekom liofilizacije bez krioprotektanta, što se može vidjeti u SEM rezultatima (slika 2a). Na temelju morfologije i FTIR rezultata dehidriranih NP inzulina, za eksperimente rekonstitucije korištene su samo liofilizirane, raspršivanjem sušene i NP bez manitola, a NP bez manitola zbog razgradnje NP bez manitola tijekom dehidracije. Raspravite.
Dehidracija se koristi za dugotrajno skladištenje i ponovnu obradu u druge formulacije. Sposobnost suhih NP-ova da se rekonstituiraju nakon skladištenja ključna je za njihovu upotrebu u različitim formulacijama kao što su tablete i filmovi. Primijetili smo da se prosječna veličina čestica inzulinskih NP-ova osušenih raspršivanjem u odsutnosti manitola samo neznatno povećala nakon rekonstitucije. S druge strane, veličina čestica inzulinskih nanočestica osušenih raspršivanjem i liofiliziranih s manitolom značajno se povećala (Tablica 1). PDI i EE nisu se značajno promijenili (p > 0,05) nakon rekombinacije svih NP-ova u ovoj studiji (Tablica 1). Ovaj rezultat ukazuje na to da je većina čestica ostala netaknuta nakon ponovnog otapanja. Međutim, dodatak manitola rezultirao je znatno smanjenim opterećenjem inzulinom liofiliziranih i osušenih raspršivanjem nanočestica manitola (Tablica 1). Nasuprot tome, sadržaj inzulina u NP-ovima osušenim raspršivanjem bez manitola ostao je isti kao i prije (Tablica 1).
Dobro je poznato da je punjenje nanočestica kritično kada se koriste za isporuku lijekova. Za NP s niskim punjenjem potrebne su vrlo velike količine materijala za postizanje terapijskog praga. Međutim, visoka viskoznost tako visokih koncentracija NP dovodi do neugodnosti i poteškoća kod oralne primjene i injekcijskih formulacija 22. Osim toga, inzulinske NP mogu se koristiti i za izradu tableta i viskoznih biofilmova 23, 24, što zahtijeva upotrebu velikih količina NP pri niskim razinama punjenja, što rezultira velikim tabletama i debelim biofilmovima koji nisu prikladni za oralnu primjenu. Stoga su dehidrirane NP s visokim opterećenjem inzulinom vrlo poželjne. Naši rezultati sugeriraju da visoko opterećenje inzulinom u NP-ima sušenim raspršivanjem bez manitola može ponuditi mnoge atraktivne prednosti za ove alternativne metode isporuke.
Sve dehidrirane NP su čuvane u hladnjaku tri mjeseca. Rezultati SEM-a pokazali su da se morfologija svih dehidriranih NP nije značajno promijenila tijekom tromjesečnog skladištenja (slika 4). Nakon rekonstitucije u vodi, sve NP su pokazale blagi pad EE i otpustile približno malu količinu (~5%) inzulina tijekom tromjesečnog razdoblja skladištenja (Tablica 2). Međutim, prosječna veličina čestica svih nanočestica se povećala. Veličina čestica NP sušenih raspršivanjem bez manitola povećala se na 525 nm, dok se veličina čestica sušenih raspršivanjem i liofiliziranih NP s manitolom povećala na 872 odnosno 921 nm (Tablica 2).
Morfologija različitih dehidriranih nanočestica inzulina pohranjenih tri mjeseca: (a) SEM slika liofiliziranih nanočestica inzulina s manitolom; (b) SEM slika osušenih raspršivanjem nanočestica inzulina bez manitola; (c) bez manitola SEM slike osušenih raspršivanjem nanočestica inzulina.
Nadalje, uočeni su talozi u rekonstituiranim inzulinskim nanočesticama sušenim raspršivanjem s manitolom i liofiliziranim (slika S2). To može biti uzrokovano velikim česticama koje se ne suspendiraju pravilno u vodi. Svi gore navedeni rezultati pokazuju da tehnika sušenja raspršivanjem može zaštititi inzulinske nanočestice od dehidracije i da se visoke količine inzulinskih nanočestica mogu dobiti bez ikakvih punila ili krioprotektanata.
Retencija inzulina testirana je u mediju pH = 2,5 s pepsinom, tripsinom i α-kimotripsinom kako bi se pokazala zaštitna sposobnost NP-a od enzimske probave nakon dehidracije. Retencija inzulina dehidriranih NP-a uspoređena je s onom kod svježe pripremljenih NP-a, a slobodni inzulin korišten je kao negativna kontrola. U ovoj studiji, slobodni inzulin pokazao je brzu eliminaciju inzulina unutar 4 sata u sva tri enzimska tretmana (slika 5a-c). Nasuprot tome, testiranje eliminacije inzulina NP-a liofiliziranih s manitolom i NP-a sušenih raspršivanjem sa ili bez manitola pokazalo je značajno veću zaštitu ovih NP-a od enzimske probave, što je bilo slično zaštiti svježe pripremljenih NP-a inzulina (slika 1).5a-c). Uz pomoć nanočestica u pepsinu, tripsinu i α-kimotripsinu, više od 50%, 60% i 75% inzulina moglo se zaštititi unutar 4 sata (slika 5a-c). Ova sposobnost zaštite inzulina može povećati vjerojatnost veće apsorpcije inzulina u krvotok25. Ovi rezultati sugeriraju da raspršivanje... Sušenje s manitolom ili bez njega te liofilizacija s manitolom mogu očuvati inzulinsko-zaštitnu sposobnost NP-a nakon dehidracije.
Zaštita i ponašanje oslobađanja dehidriranih NP inzulina: (a) zaštita inzulina u otopini pepsina; (b) zaštita inzulina u otopini tripsina; (c) zaštita inzulina otopinom α-kimotripsina; (d) Ponašanje oslobađanja dehidriranih NP u otopini pH = 2,5; (e) ponašanje oslobađanja dehidriranih NP u otopini pH = 6,6; (f) ponašanje oslobađanja dehidriranih NP u otopini pH = 7,0.
Svježe pripremljene i rekonstituirane suhe nanočestice inzulina inkubirane su u različitim puferima (pH = 2,5, 6,6, 7,0) na 37 °C, simulirajući pH okruženje želuca, dvanaesnika i gornjeg tankog crijeva, kako bi se ispitao učinak inzulina na inzulinsku rezistenciju. Ponašanje oslobađanja u različitim okruženjima. Fragment gastrointestinalnog trakta. Pri pH = 2,5, NP napunjene inzulinom i resolucifirane suhe NP inzulina pokazale su početno naglo oslobađanje unutar prvog sata, nakon čega je slijedilo sporo oslobađanje tijekom sljedećih 5 sati (slika 5d). Ovo brzo oslobađanje na početku najvjerojatnije je rezultat brze površinske desorpcije proteinskih molekula koje nisu potpuno imobilizirane u unutarnjoj strukturi čestice. Pri pH = 6,5, NP napunjene inzulinom i rekonstituirane suhe NP inzulina pokazale su glatko i sporo oslobađanje tijekom 6 sati, budući da je pH testne otopine bio sličan pH otopine pripremljene s NP (slika 5e). Pri pH = 7, NP su bile nestabilne i gotovo potpuno su se razgradile unutar prva dva sata (slika 5f). To je zato što se deprotonacija hitosana događa pri višem pH, što rezultira manje kompaktnom polimernom mrežom i oslobađanjem napunjenog inzulina.
Nadalje, inzulinske NP osušene raspršivanjem bez manitola pokazale su brži profil oslobađanja od ostalih dehidriranih NP (slika 5d-f). Kao što je prethodno opisano, rekonstituirane inzulinske NP osušene bez manitola pokazale su najmanju veličinu čestica. Male čestice pružaju veću površinu, tako da će većina relevantnog lijeka biti na ili blizu površine čestice, što rezultira brzim oslobađanjem lijeka26.
Citotoksičnost NP-ova istražena je MTT testom. Kao što je prikazano na slici S4, utvrđeno je da sve dehidrirane NP-ove nemaju značajan utjecaj na vijabilnost stanica pri koncentracijama od 50–500 μg/ml, što sugerira da se sve dehidrirane NP-ove mogu sigurno koristiti za postizanje terapijskog prozora.
Jetra je glavni organ putem kojeg inzulin ostvaruje svoje fiziološke funkcije. HepG2 stanice su stanična linija ljudskog hepatoma koja se obično koristi kao in vitro model unosa hepatocita. Ovdje su HepG2 stanice korištene za procjenu staničnog unosa dehidriranih NP-ova korištenjem metoda liofilizacije i sušenja raspršivanjem. Stanični unos konfokalnim laserskim skeniranjem protočnom citometrijom i vidom nakon nekoliko sati inkubacije sa slobodnim FITC inzulinom u koncentraciji od 25 μg/mL, svježe pripremljenim FITC inzulinom napunjenim NP-ovima i dehidriranim FITC inzulinom napunjenim NP-ovima pri jednakim koncentracijama inzulina. Provedena su kvantitativna mikroskopska (CLSM) promatranja. Liofilizirane NP-ove bez manitola uništene su tijekom dehidracije i nisu procijenjene u ovom testu. Intenziteti unutarstanične fluorescencije svježe pripremljenih NP-ova napunjenih inzulinom, liofiliziranih NP-ova s ​​manitolom i raspršivanjem osušenih NP-ova sa i bez manitola (slika 6a) bili su 4,3, 2,6, 2,4 i 4,1 puta veći od slobodnih. FITC-inzulinska skupina, respektivno. (Sl. 6b). Ovi rezultati upućuju na to da je enkapsulirani inzulin potentniji u staničnom unosu od slobodnog inzulina, uglavnom zbog manje veličine nanočestica opterećenih inzulinom proizvedenih u studiji.
Unos u HepG2 stanice nakon 4 sata inkubacije sa svježe pripremljenim NP i dehidriranim NP: (a) Raspodjela unosa FITC-inzulina u HepG2 stanice. (b) Geometrijska sredina intenziteta fluorescencije analizirana protočnom citometrijom (n = 3), *P < 0,05 u usporedbi sa slobodnim inzulinom.
Isto tako, CLSM slike su pokazale da su intenziteti FITC fluorescencije svježe pripremljenih NP-ova s ​​FITC-inzulinom i NP-ova s ​​FITC-inzulinom osušenih raspršivanjem (bez manitola) bili mnogo jači od onih u ostalim uzorcima (slika 6a). Nadalje, uz dodatak manitola, veća viskoznost otopine povećala je otpornost na staničnu apsorpciju, što je rezultiralo smanjenom proliferacijom inzulina. Ovi rezultati sugeriraju da su NP-ovi osušeni raspršivanjem bez manitola pokazali najveću učinkovitost stanične apsorpcije jer je njihova veličina čestica bila manja od veličine čestica liofiliziranih NP-ova nakon ponovnog otapanja.
Kitozan (prosječne molekularne težine 100 KDa, 75–85% deacetiliran) kupljen je od tvrtke Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Natrijev tripolifosfat (TPP) kupljen je od tvrtke VWR (Radnor, Pennsylvania, SAD). Rekombinantni humani inzulin korišten u ovoj studiji nabavljen je od tvrtke Fisher Scientific (Waltham, MA, SAD). Humani inzulin obilježen fluorescein izotiocijanatom (FITC) i 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorid (DAPI) kupljeni su od tvrtke Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Stanična linija HepG2 dobivena je od tvrtke ATCC (Manassas, Virginia, SAD). Svi ostali reagensi bili su analitičke ili kromatografske čistoće.
Pripremite otopinu CS koncentracije 1 mg/ml otapanjem u dvostruko destiliranoj vodi (DD voda) koja sadrži 0,1% octene kiseline. Pripremite otopine TPP-a i inzulina koncentracije 1 mg/ml otapanjem u DD vodi i 0,1% octenoj kiselini. Predemulzija je pripremljena pomoću homogenizatora velike brzine Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, SAD). Postupak pripreme je sljedeći: prvo se 2 ml otopine TPP doda u 4 ml otopine inzulina, a smjesa se miješa 30 minuta i dobro promiješa. Zatim se miješana otopina dodaje kap po kap u otopinu CS pomoću štrcaljke uz miješanje velikom brzinom (10 000 okretaja u minuti). Smjese su držane uz miješanje velikom brzinom (15 000 okretaja u minuti) u ledenoj kupelji 30 minuta, a pH im je podešen na određeni kako bi se dobile umrežene NP inzulina. Kako bi se dodatno homogenizirale i smanjila veličina čestica NP inzulina, sonicirane su dodatnih 30 minuta u ledenoj kupelji pomoću sonikatora tipa sonde (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Njemačka).
NPS inzulina testirani su na Z-prosječni promjer, indeks polidisperznosti (PDI) i zeta potencijal mjerenjem dinamičkog raspršenja svjetlosti (DLS) pomoću Litesizera 500 (Anton Paar, Graz, Austrija) razrjeđivanjem u DD vodi na 25°C. Morfologija i raspodjela veličine karakterizirane su Hitachi H7600 transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM) (Hitachi, Tokio, Japan), a slike su potom analizirane pomoću Hitachi softvera za obradu slika (Hitachi, Tokio, Japan). Kako bi se procijenila učinkovitost enkapsulacije (EE) i kapacitet punjenja (LC) NP inzulina, NP su pipetirane u ultrafiltracijske epruvete s graničnom molekularnom težinom od 100 kDa i centrifugirane pri 500 x g tijekom 30 minuta. Neenkapsulirani inzulin u filtratu kvantificiran je pomoću Agilent 1100 Series HPLC sustava (Agilent, Santa Clara, Kalifornija, SAD) koji se sastoji od kvaternarne pumpe, automatskog uzorkovača, grijača kolone i DAD detektora. Inzulin je analiziran. pomoću kolone C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, SAD) i detektirano na 214 nm. Mobilna faza bila je acetonitril i voda, s 0,1% TFA, omjeri gradijenta od 10/90 do 100/0, a reakcijska smjesa trajala je 10 minuta. Mobilna faza pumpana je brzinom protoka od 1,0 ml/min. Temperatura kolone postavljena je na 20 °C. Izračunajte postotke EE i LC koristeći jednadžbe (1) i jednadžbu (2).
Različiti omjeri CS/inzulina u rasponu od 2,0 do 4,0 testirani su kako bi se optimizirala NP inzulina. Različite količine otopine CS dodavane su tijekom pripreme, dok je smjesa inzulina/TPP održavana konstantnom. NP inzulina pripremljene su u rasponu pH od 4,0 do 6,5 pažljivom kontrolom pH smjese nakon dodavanja svih otopina (inzulina, TPP i CS). EE i veličina čestica nanočestica inzulina procijenjene su pri različitim pH vrijednostima i masenim omjerima CS/inzulina kako bi se optimiziralo stvaranje NP inzulina.
Optimizirane inzulinske NP postavljene su na aluminijsku posudu i prekrivene tkivom zategnutim ljepljivom trakom. Nakon toga, vijčane posude stavljene su u Labconco FreeZone liofilizator (Labconco, Kansas City, MO, SAD) opremljen sušilicom s ladicama. Temperatura i vakuumski tlak postavljeni su na -10 °C, 0,350 Torr tijekom prva 2 sata, te 0 °C i 0,120 Torr tijekom preostalih 22 sata od 24 sata kako bi se dobile suhe inzulinske NP.
Za proizvodnju enkapsuliranog inzulina korišten je Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Švicarska). Odabrani parametri sušenja bili su: temperatura 100 °C, protok ulazne smjese 3 L/min i protok plina 4 L/min.
Nanočestice inzulina prije i nakon dehidracije karakterizirane su FTIR-ATR spektroskopijom. Dehidrirane nanočestice, kao i slobodni inzulin i kitozan, analizirani su pomoću Spectrum 100 FTIR spektrofotometra (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, SAD) opremljenog univerzalnim ATR dodatkom za uzorkovanje (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, SAD). Prosjeci signala dobiveni su iz 16 skeniranja pri rezoluciji od 4 cm2 u frekvencijskom rasponu od 4000-600 cm2.
Morfologija suhih inzulinskih NP procijenjena je SEM slikama liofiliziranih i raspršivanjem sušenih inzulinskih NP snimljenih Helios NanoLab 650 fokusiranim ionskim skenirajućim elektronskim mikroskopom (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, SAD). Glavni korišteni parametar bio je napon 5 keV i struja 30 mA.
Sve dehidrirane inzulinske NP ponovno su otopljene u dd vodi. Veličina čestica, PDI, EE i LC ponovno su testirani istom metodom spomenutom ranije kako bi se procijenila njihova kvaliteta nakon dehidracije. Stabilnost anhidroinzulinskih NP također je mjerena testiranjem svojstava NP nakon duljeg skladištenja. U ovoj studiji, sve NP nakon dehidracije pohranjene su u hladnjaku tri mjeseca. Nakon tri mjeseca skladištenja, NP su testirane na morfološku veličinu čestica, PDI, EE i LC.
Otopite 5 mL rekonstituiranih NP u 45 mL koji sadrži simuliranu želučanu tekućinu (pH 1,2, koja sadrži 1% pepsina), crijevnu tekućinu (pH 6,8, koja sadrži 1% tripsina) ili otopinu kimotripsina (100 g/mL, u fosfatnom puferu, pH 7,8) kako biste procijenili učinkovitost inzulina u zaštiti NP nakon dehidracije. Inkubirane su na 37°C uz brzinu miješanja od 100 okretaja u minuti. 500 μL otopine prikupljeno je u različitim vremenskim točkama, a koncentracija inzulina određena je HPLC-om.
Ponašanje oslobađanja svježe pripremljenih i dehidriranih NP inzulina in vitro testirano je metodom dijalizne vrećice (granična molekularna težina 100 kDa, Spectra Por Inc.). Svježe pripremljene i rekonstituirane suhe NP dijalizirane su u tekućinama pri pH 2,5, pH 6,6 i pH 7,0 (0,1 M fosfatno puferirana fiziološka otopina, PBS) kako bi se simulirao pH okoliš želuca, dvanaesnika i gornjeg tankog crijeva. Svi uzorci inkubirani su na 37 °C uz kontinuirano tresenje pri 200 okretaja u minuti. Aspirirajte tekućinu izvan dijalizne vrećice od 5 mL u sljedećim vremenima: 0,5, 1, 2, 3, 4 i 6 sati i odmah nadopunite volumen svježim dijalizatom. Kontaminacija inzulinom u tekućini analizirana je HPLC-om, a brzina oslobađanja inzulina iz nanočestica izračunata je iz omjera oslobođenog slobodnog inzulina i ukupnog inzulina enkapsuliranog u nanočesticama (jednadžba 3).
Stanična linija humanog hepatocelularnog karcinoma HepG2 uzgajana je u posudama promjera 60 mm pomoću Dulbeccoovog modificiranog Eagleovog medija (DMEM) koji je sadržavao 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 IU/mL penicilina i 100 μg/mL streptomicina29. Kulture su održavane na 37°C, 95% relativne vlažnosti i 5% CO2. Za testove apsorpcije, HepG2 stanice su posijane u koncentraciji od 1 × 10⁶ stanica/ml na Nunc Lab-Tek sustav slajdova s ​​8 jažica (Thermo Fisher, NY, SAD). Za testove citotoksičnosti, posijane su u ploče s 96 jažica (Corning, NY, SAD) u gustoći od 5 × 10⁶ stanica/ml.
MTT test je korišten za procjenu citotoksičnosti svježe pripremljenih i dehidriranih inzulinskih NP30. Stanice HepG2 su posijane u ploče s 96 jažica gustoćom od 5 × 10⁴ stanica/mL i uzgajane 7 dana prije testiranja. Inzulinske NP su razrijeđene na različite koncentracije (50 do 500 μg/mL) u mediju za kulturu, a zatim primijenjene na stanice. Nakon 24 sata inkubacije, stanice su 3 puta isprane s PBS-om i inkubirane s medijem koji sadrži 0,5 mg/ml MTT-a dodatna 4 sata. Citotoksičnost je procijenjena mjerenjem enzimske redukcije žutog tetrazolijevog MTT-a u ljubičasti formazan na 570 nm pomoću Tecan infinite M200 pro spektrofotometra za čitanje ploča (Tecan, Männedorf, Švicarska).
Učinkovitost stanične apsorpcije NP testirana je konfokalnom laserskom skenirajućom mikroskopijom i analizom protočnom citometrijom. Svaka jažica Nunc Lab-Tek komornog sustava tretirana je slobodnim FITC-inzulinom, NP-ima napunjenim FITC-inzulinom i rekonstituiranim 25 μg/mL dehidriranih FITC-inzulinskih NP-a iste koncentracije te inkubirana 4 sata. Stanice su isprane 3 puta s PBS-om i fiksirane s 4% paraformaldehidom. Jezgre su obojene 4',6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI). Lokalizacija inzulina promatrana je pomoću Olympus FV1000 laserskog skenirajućeg/dvofotonskog konfokalnog mikroskopa (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japan). Za analizu protočnom citometrijom, iste koncentracije od 10 μg/mL slobodnog FITC-inzulina, NP-ima napunjenih FITC-inzulinom i resolubiliziranih dehidriranih FITC-inzulinskih NP-a dodane su na ploče s 96 jažica zasijane HepG2 stanicama i inkubirane 4 sata. Nakon 4 sata inkubacije, stanice su uklonjene i isprane 3 puta s FBS-om. 5 × 10⁴ stanica po uzorku analizirano je protočnim citometrom BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Sjedinjene Američke Države).
Sve vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Usporedbe između svih skupina procijenjene su korištenjem jednosmjerne ANOVA ili t-testa pomoću IBM SPSS Statistics 26 za Mac (IBM, Endicott, New York, SAD), a vrijednost p < 0,05 smatrana je statistički značajnom.
Ova studija pokazuje fleksibilnost i sposobnost sušenja raspršivanjem da dehidrira umrežene nanočestice kitosan/TPP/inzulin s boljom rekonstitucijom u usporedbi sa standardnim metodama sušenja smrzavanjem korištenjem sredstava za povećanje volumena ili krioprotektanata i većim kapacitetom opterećenja. Optimizirane nanočestice inzulina dale su prosječnu veličinu čestica od 318 nm i učinkovitost enkapsulacije od 99,4%. Rezultati SEM i FTIR nakon dehidracije pokazali su da je sferična struktura održana samo u nanočesticama osušenim raspršivanjem s i bez manitola te liofiliziranim s manitolom, ali liofilizirane nanočestice bez manitola razgradile su se tijekom dehidracije. U testu sposobnosti rekonstitucije, nanočestice inzulina osušene raspršivanjem bez manitola pokazale su najmanju prosječnu veličinu čestica i najveće punjenje nakon rekonstitucije. Ponašanje oslobađanja svih ovih dehidriranih nanočestica pokazalo je da su se brzo oslobađale u otopinama pH = 2,5 i pH = 7, te vrlo stabilne u otopini pH = 6,5. U usporedbi s drugim ponovno otopljenim dehidriranim nanočesticama, nanočestice osušene raspršivanjem bez manitola pokazale su najbrže... oslobađanje. Ovaj rezultat je u skladu s onim uočenim u testu staničnog unosa, budući da su nanočestice osušene raspršivanjem u odsutnosti manitola gotovo u potpunosti zadržale učinkovitost staničnog unosa svježe pripremljenih nanočestica. Ovi rezultati sugeriraju da su suhe inzulinske nanočestice pripremljene sušenjem raspršivanjem bez manitola najprikladnije za daljnju obradu u druge bezvodne oblike doziranja, kao što su oralne tablete ili bioadhezivni filmovi.
Zbog pitanja intelektualnog vlasništva, skupovi podataka generirani i/ili analizirani tijekom ove studije nisu javno dostupni, ali su dostupni od odgovarajućih autora na razuman zahtjev.
Kagan, A. Dijabetes tipa 2: društveno i znanstveno podrijetlo, medicinske komplikacije i implikacije za pacijente i druge. (McFarlane, 2009.).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. i Jiang, P. Razvoj enkapsulacije inzulina: je li oralna primjena sada moguća? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. i Dass, CR Nedavni napredak u oralnim sustavima za isporuku liposoma s inzulinom za liječenje dijabetesa. Interpretacija. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).