Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje rezultate preporučujemo da koristite noviju verziju preglednika (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazujemo stranicu bez stiliziranja ili JavaScripta.
Propionska kiselina (PPA) koristi se za proučavanje uloge mitohondrijske disfunkcije u neurološkim razvojnim poremećajima poput poremećaja iz autističnog spektra. Poznato je da PPA remeti mitohondrijsku biogenezu, metabolizam i promet. Međutim, učinci PPA na mitohondrijsku dinamiku, fisiju i fuziju ostaju problematični zbog složene vremenske prirode tih mehanizama. Ovdje koristimo komplementarne kvantitativne tehnike snimanja kako bismo istražili kako PPA utječe na mitohondrijsku ultrastrukturu, morfologiju i dinamiku u neuronskim SH-SY5Y stanicama. PPA (5 mM) uzrokovao je značajno smanjenje mitohondrijske površine (p < 0,01), Feretovog promjera i opsega (p < 0,05) i površine 2 (p < 0,01). Analiza lokatora mitohondrijskih događaja pokazala je značajno povećanje (p < 0,05) fisijskih i fuzijskih događaja, čime se održava integritet mitohondrijske mreže u stresnim uvjetima. Osim toga, ekspresija mRNA cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) i OPA1 (p < 0,05) bila je značajno smanjena. 01). To ilustrira preoblikovanje mitohondrijske morfologije, biogeneze i dinamike kako bi se održala funkcija u stresnim uvjetima. Naši podaci pružaju novi uvid u učinke PPA na mitohondrijsku dinamiku i ističu korisnost tehnika snimanja za proučavanje složenih regulatornih mehanizama uključenih u mitohondrijske odgovore na stres.
Mitohondriji su sastavni sudionici u raznim staničnim funkcijama koje nadilaze njihove tipične uloge u proizvodnji energije i biosintezi. Mitohondrijski metabolizam ključni je regulator kalcijeve signalizacije, metaboličke i redoks homeostaze, upalne signalizacije, epigenetskih modifikacija, stanične proliferacije, diferencijacije i programirane stanične smrti1. Mitohondrijski metabolizam posebno je ključan za razvoj, preživljavanje i funkciju neurona te je uvelike povezan s raznim manifestacijama neuropatologije2,3,4.
Tijekom proteklog desetljeća, metabolički status se pojavio kao središnji regulator neurogeneze, diferencijacije, sazrijevanja i plastičnosti5,6. Nedavno su mitohondrijska morfologija i dinamika postale posebno važne komponente mitoze, dinamičkog procesa koji održava skup zdravih mitohondrija unutar stanica. Mitohondrijska dinamika regulirana je složenim međuovisnim putovima koji se kreću od mitohondrijske biogeneze i bioenergetike do mitohondrijske fisije, fuzije, transporta i čišćenja7,8. Poremećaj bilo kojeg od ovih integrativnih mehanizama narušava održavanje zdravih mitohondrijskih mreža i ima duboke funkcionalne posljedice za neurološki razvoj9,10. Doista, disregulacija mitohondrijske dinamike opažena je kod mnogih psihijatrijskih, neurodegenerativnih i neurorazvojnih poremećaja, uključujući poremećaje iz autističnog spektra (PAS)11,12.
ASD je heterogeni neurološki razvojni poremećaj sa složenom genetskom i epigenetskom arhitekturom. Nasljednost ASD-a je neosporna, ali temeljna molekularna etiologija ostaje slabo shvaćena. Prikupljanje podataka iz predkliničkih modela, kliničkih studija i multi-omskih molekularnih skupova podataka pruža sve više dokaza o mitohondrijskoj disfunkciji kod ASD-a13,14. Prethodno smo proveli probir metilacije DNA na razini cijelog genoma u kohorti pacijenata s ASD-om i identificirali različito metilirane gene grupirane duž mitohondrijskih metaboličkih putova15. Naknadno smo izvijestili o diferencijalnoj metilaciji središnjih regulatora mitohondrijske biogeneze i dinamike, što je bilo povezano s povećanim brojem kopija mtDNA i promijenjenim metaboličkim profilom urina kod ASD-a16. Naši podaci pružaju sve više dokaza da mitohondrijska dinamika i homeostaza igraju središnju ulogu u patofiziologiji ASD-a. Stoga je poboljšanje mehanističkog razumijevanja odnosa između mitohondrijske dinamike, morfologije i funkcije ključni cilj tekućih istraživanja neuroloških bolesti karakteriziranih sekundarnom mitohondrijskom disfunkcijom.
Molekularne tehnike često se koriste za proučavanje uloge specifičnih gena u mitohondrijskim stresnim odgovorima. Međutim, ovaj pristup može biti ograničen višestrukom i vremenskom prirodom mehanizama mitotičke kontrole. Štoviše, diferencijalna ekspresija mitohondrijskih gena indirektni je pokazatelj funkcionalnih promjena, posebno zato što se obično analizira samo ograničen broj gena. Stoga su predložene izravnije metode za proučavanje mitohondrijske funkcije i bioenergetike17. Mitohondrijska morfologija usko je povezana s mitohondrijskom dinamikom. Oblik, povezanost i struktura mitohondrija ključni su za proizvodnju energije te preživljavanje mitohondrija i stanica5,18. Štoviše, različite komponente mitoze usredotočuju se na promjene u mitohondrijskoj morfologiji, što može poslužiti kao korisne krajnje točke mitohondrijske disfunkcije i pružiti osnovu za naknadne mehanističke studije.
Mitohondrijska morfologija može se izravno promatrati pomoću transmisijske elektronske mikroskopije (TEM), što omogućuje detaljno proučavanje stanične ultrastrukture. TEM izravno vizualizira morfologiju, oblik i strukturu mitohondrijskih krista pri razlučivanju pojedinačnih mitohondrija, umjesto da se oslanja isključivo na transkripciju gena, ekspresiju proteina ili mitohondrijske funkcionalne parametre u staničnim populacijama17,19,20. Osim toga, TEM olakšava proučavanje interakcija između mitohondrija i drugih organela, poput endoplazmatskog retikuluma i autofagosoma, koji igraju ključnu ulogu u mitohondrijskoj funkciji i homeostazi21,22. Stoga je TEM dobra polazna točka za proučavanje mitohondrijske disfunkcije prije fokusiranja na specifične putove ili gene. Kako mitohondrijska funkcija postaje sve relevantnija za neuropatologiju, postoji jasna potreba za izravnim i kvantitativnim proučavanjem mitohondrijske morfologije i dinamike u in vitro neuronskim modelima.
U ovom članku ispitujemo mitohondrijsku dinamiku u neuronskom modelu mitohondrijske disfunkcije kod poremećaja iz autističnog spektra. Prethodno smo izvijestili o diferencijalnoj metilaciji propionil-CoA karboksilaze beta (PCCB) u ASD15, podjedinici mitohondrijskog enzima propionil-CoA karboksilaze PCC. Poznato je da disregulacija PCC uzrokuje toksično nakupljanje propionilnih derivata, uključujući propionsku kiselinu (PPA)23,24,25. Pokazalo se da PPA remeti neuronski metabolizam i mijenja ponašanje in vivo te je utvrđeni životinjski model za proučavanje neurorazvojnih mehanizama uključenih u ASD26,27,28. Osim toga, zabilježeno je da PPA remeti potencijal mitohondrijske membrane, biogenezu i disanje in vitro te se široko koristi za modeliranje mitohondrijske disfunkcije u neuronima29,30. Međutim, utjecaj mitohondrijske disfunkcije izazvane PPA na morfologiju i dinamiku mitohondrija ostaje slabo shvaćen.
Ova studija koristi komplementarne tehnike snimanja za kvantificiranje učinaka PPA na mitohondrijsku morfologiju, dinamiku i funkciju u SH-SY5Y stanicama. Prvo smo razvili TEM metodu za vizualizaciju promjena u mitohondrijskoj morfologiji i ultrastrukturi17,31,32. S obzirom na dinamičku prirodu mitohondrija33, također smo koristili analizu lokalizatora mitohondrijskih događaja (MEL) za kvantificiranje promjena u ravnoteži između događaja fisije i fuzije, broja i volumena mitohondrija pod stresom PPA. Konačno, ispitali smo jesu li mitohondrijska morfologija i dinamika povezane s promjenama u ekspresiji gena uključenih u biogenezu, fisiju i fuziju. Uzeti zajedno, naši podaci ilustriraju izazov razjašnjavanja složenosti mehanizama koji reguliraju mitohondrijsku dinamiku. Ističemo korisnost TEM-a u proučavanju mitohondrijske morfologije kao mjerljive konvergentne krajnje točke mitoze u SH-SY5Y stanicama. Osim toga, ističemo da TEM podaci pružaju najbogatije informacije kada se kombiniraju s tehnikama snimanja koje također bilježe dinamičke događaje kao odgovor na metabolički stres. Daljnja karakterizacija molekularnih regulatornih mehanizama koji podržavaju mitozo neuronskih stanica može pružiti važan uvid u mitohondrijsku komponentu živčanog sustava i neurodegenerativne bolesti.
Kako bi se izazvao mitohondrijski stres, SH-SY5Y stanice su tretirane s PPA korištenjem 3 mM i 5 mM natrijevog propionata (NaP). Prije TEM-a, uzorci su podvrgnuti kriogenoj pripremi uzoraka korištenjem visokotlačnog smrzavanja i zamrzavanja (slika 1a). Razvili smo automatizirani cjevovod za analizu mitohondrijske slike kako bismo izmjerili osam morfoloških parametara mitohondrijskih populacija u tri biološka ponavljanja. Otkrili smo da je tretman PPA značajno promijenio četiri parametra: površinu 2, površinu, perimetar i Feretov promjer (slika 1b-e). Površina 2 značajno se smanjila i s tretmanom s 3 mM i s 5 mM PPA (p = 0,0183 odnosno p = 0,002) (slika 1b), dok su se površina (p = 0,003), perimetar (p = 0,0106) i Feretov promjer značajno smanjili. Došlo je do značajnog smanjenja (p = 0,0172) u skupini tretiranoj s 5 mM u usporedbi s kontrolnom skupinom (slika 1c-e). Značajna smanjenja površine i opsega pokazala su da stanice tretirane s 5 mM PPA imaju manje, zaobljenije mitohondrije te da su ti mitohondriji manje izduženi od onih u kontrolnim stanicama. To je također u skladu sa značajnim smanjenjem Feretovog promjera, neovisnog parametra koji ukazuje na smanjenje najveće udaljenosti između rubova čestica. Uočene su promjene u ultrastrukturi krista: kriste su postale manje izražene pod utjecajem PPA stresa (slika 1a, ploča B). Međutim, nisu sve slike jasno odražavale ultrastrukturu krista, pa nije provedena kvantitativna analiza tih promjena. Ovi TEM podaci mogu odražavati tri moguća scenarija: (1) PPA pojačava fisiju ili inhibira fuziju, uzrokujući smanjenje postojećih mitohondrija; (2) pojačana biogeneza stvara nove, manje mitohondrije ili (3) istovremeno inducira oba mehanizma. Iako se ovi uvjeti ne mogu razlikovati TEM-om, značajne morfološke promjene ukazuju na promjene u mitohondrijskoj homeostazi i dinamici pod PPA stresom. Naknadno smo istražili dodatne parametre kako bismo dodatno okarakterizirali ovu dinamiku i potencijalne mehanizme koji leže u njenoj osnovi.
Propionska kiselina (PPA) preoblikuje morfologiju mitohondrija. (a) Reprezentativne slike transmisijske elektronske mikroskopije (TEM) koje pokazuju da se veličina mitohondrija smanjuje, a mitohondriji postaju manji i zaobljeniji s povećanjem tretmana PPA; 0 mM (netretirano), 3 mM i 5 mM. Crvene strelice označavaju mitohondrije. (b–e) SH-SY5Y stanice tretirane s PPA tijekom 24 sata pripremljene su za TEM, a rezultati su analizirani pomoću Fiji/ImageJ. Četiri od osam parametara pokazala su značajne razlike između kontrolnih (netretiranih, 0 mM PPA) i tretiranih (3 mM i 5 mM PPA) stanica. (b) Regija 2, (c) Površina, (d) Perimetar, (e) Feretov promjer. Jednosmjerna analiza varijance (kontrola vs. tretman) i Dunnettov test višestruke usporedbe korišteni su za određivanje značajnih razlika (p < 0,05). Podatkovne točke predstavljaju prosječnu vrijednost mitohondrija za svaku pojedinačnu stanicu, a stupci pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± SEM. Prikazani podaci predstavljaju n = 3, najmanje 24 stanice po ponavljanju; ukupno je analizirano 266 slika; * označava p < 0,05, ** označava p < 0,01.
Kako bismo dodatno okarakterizirali kako mitohondrijska dinamika reagira na PPA, obojali smo mitohondrije tetrametilrodamin etil esterom (TMRE) i koristili mikroskopiju s vremenskim prekidom i MEL analizu kako bismo lokalizirali i kvantificirali mitohondrije nakon 24 sata pri 3 i 5 mM PPA. Tretman događaja fisije i fuzije. (Slika 2a). Nakon MEL analize, mitohondriji su dalje analizirani kako bi se kvantificirao broj mitohondrijskih struktura i njihov prosječni volumen. Uočili smo malo, ali značajno povećanje broja događaja fisije koji se javljaju pri 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] u usporedbi s finijom [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] i fuzijom [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] te fuzijom [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] [0,05)] [<0,05)] i značajno povećanje broja događaja fisije pri 5 mM u usporedbi s kontrolom (Slika 3b). Broj mitohondrija značajno se povećao i pri 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] i pri 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (slika 3c), dok je prosječni volumen svake mitohondrijske strukture ostao nepromijenjen (slika 3c). 3d). Uzevši sve u obzir, to sugerira da preoblikovanje mitohondrijske dinamike služi kao kompenzacijski odgovor koji uspješno održava integritet mitohondrijske mreže. Povećanje broja fisijskih događaja pri 3 mM PPA sugerira da je povećanje broja mitohondrija djelomično posljedica mitohondrijske fisije, ali s obzirom na to da prosječni volumen mitohondrija ostaje u biti nepromijenjen, biogeneza se ne može isključiti kao dodatni kompenzacijski odgovor. Međutim, ovi podaci su u skladu s manjim, okruglim mitohondrijskim strukturama uočenim TEM-om i također pokazuju značajne promjene u mitohondrijskoj dinamici izazvane PPA.
Propionska kiselina (PPA) inducira dinamičko mitohondrijsko preoblikovanje kako bi se održao integritet mreže. SH-SY5Y stanice su uzgajane, tretirane s 3 i 5 mM PPA tijekom 24 sata i obojene s TMRE i Hoechst 33342, nakon čega je slijedila MEL analiza. (a) Reprezentativne slike mikroskopije s vremenskim odmakom koje prikazuju projekcije boje i binarizirane projekcije maksimalnog intenziteta u vremenu 2 (t2) za svako stanje. Odabrana područja naznačena na svakoj binarnoj slici su poboljšana i prikazana u 3D u tri različita vremenska okvira (t1-t3) kako bi se ilustrirala dinamika tijekom vremena; događaji fuzije su označeni zelenom bojom; događaji fisije su označeni zelenom bojom. Prikazano crvenom bojom. (b) Prosječan broj dinamičkih događaja po stanju. (c) Prosječan broj mitohondrijskih struktura po stanici. (d) Prosječni volumen (µm3) svake mitohondrijske strukture po stanici. Prikazani podaci su reprezentativni za n = 15 stanica po skupini tretmana. Prikazane trake pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± SEM, skala = 10 μm, * p < 0,05.
Propionska kiselina (PPA) uzrokuje transkripcijsku supresiju gena povezanih s mitohondrijskom dinamikom. SH-SY5Y stanice tretirane su s 3 i 5 mM PPA tijekom 24 sata. Relativna kvantifikacija gena provedena je pomoću RT-qPCR i normalizirana na B2M. Geni mitohondrijalne biogeneze (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 i (d) NFE2L2. Geni mitohondrijalne fuzije i fisije (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 i (i) DRP1. Značajne razlike (p < 0,05) testirane su pomoću jednosmjerne ANOVA (kontrola vs. tretman) i Dunnettovog testa višestruke usporedbe: * označava p < 0,05, ** označava p < 0,01, a **** označava p < 0,0001. Stupci predstavljaju srednju ekspresiju ± SEM. Prikazani podaci predstavljaju n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) i n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) bioloških replikata.
Podaci iz TEM i MEL analiza zajedno ukazuju na to da PPA mijenja morfologiju i dinamiku mitohondrija. Međutim, ove tehnike snimanja ne pružaju uvid u temeljne mehanizme koji pokreću te procese. Stoga smo ispitali ekspresiju mRNA devet ključnih regulatora mitohondrijske dinamike, biogeneze i mitoze kao odgovor na tretman PPA. Kvantificirali smo onkogen staničnog mijeloma (cMYC), nuklearni respiratorni faktor (NRF1), mitohondrijski transkripcijski faktor 1 (TFAM), NFE2-sličan transkripcijski faktor BZIP (NFE2L2), protein sličan gastrinu 2 (STOML2), atrofiju vidnog živca 1 (OPA1), mitofuzin 1 (MFN1), mitofuzin 2 (MFN2) i protein povezan s dinaminom 1 (DRP1) nakon 24 sata tretmana s 3 mM i 5 mM PPA. Uočili smo tretman PPA s 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 i p < 0,0001) i 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Sl. 3a–c). Smanjenje ekspresije mRNA bilo je ovisno o dozi: ekspresija cMYC, NRF1 i TFAM smanjila se za 5,7, 2,6 i 1,9 puta pri 3 mM, te za 11,2, 3 i 2,2 puta pri 5 mM. Nasuprot tome, gen središnje redoks biogeneze NFE2L2 nije se promijenio ni pri jednoj koncentraciji PPA, iako je uočen sličan trend smanjene ekspresije ovisan o dozi (Sl. 3d).
Također smo ispitali ekspresiju klasičnih gena uključenih u regulaciju fisije i fuzije. Smatra se da je STOML2 uključen u fuziju, mitofagiju i biogenezu, a njegova ekspresija je značajno smanjena (p < 0,0001) za 3 mM (promjena od 2,4 puta) i 5 mM (promjena od 2,8 puta) PPA (slika 1). 3d). Slično tome, ekspresija fuzijskog gena OPA1 smanjena je pri 3 mM (promjena od 1,6 puta) i 5 mM (promjena od 1,9 puta) PPA (p = 0,006 i p = 0,0024) (slika 3f). Međutim, nismo pronašli značajne razlike u ekspresiji fuzijskih gena MFN1, MFN2 ili fisijskog gena DRP1 pod 24-satnim PPA stresom (slika 3g–i). Osim toga, otkrili smo da se razine četiriju fuzijskih i fisijskih proteina (OPA1, MFN1, MFN2 i DRP1) nisu promijenile pod istim uvjetima (slika 4a–d). Važno je napomenuti da ovi podaci odražavaju jednu vremensku točku i ne moraju odražavati promjene u ekspresiji proteina ili razinama aktivnosti tijekom ranih faza stresa uzrokovanih PPA. Međutim, značajno smanjenje ekspresije cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 i OPA1 ukazuje na značajnu transkripcijsku disregulaciju mitohondrijskog metabolizma, biogeneze i dinamike. Osim toga, ovi podaci ističu korisnost tehnika snimanja za izravno proučavanje promjena završnog stanja mitohondrijske funkcije.
Razine proteina fuzijskog i fisijskog faktora nisu se promijenile nakon tretmana propionskom kiselinom (PPA). SH-SY5Y stanice tretirane su s 3 i 5 mM PPA tijekom 24 sata. Razine proteina kvantificirane su Western blot analizom, a razine ekspresije normalizirane su na ukupni protein. Prikazana je prosječna ekspresija proteina i reprezentativni Western blotovi ciljnog i ukupnog proteina. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Stupci predstavljaju srednju vrijednost ± SEM, a prikazani podaci reprezentativni su za n = 3 biološka ponavljanja. Višestruke usporedbe (p < 0,05) provedene su jednosmjernom analizom varijance i Dunnettovim testom. Izvorni gel i blot prikazani su na slici S1.
Mitohondrijska disfunkcija povezana je s multisistemskim bolestima, od metaboličkih, kardiovaskularnih i mišićnih bolesti do neuroloških bolesti1,10. Mnoge neurodegenerativne i neurodegenerativne bolesti povezane su s mitohondrijskom disfunkcijom, što naglašava važnost ovih organela tijekom cijelog životnog vijeka mozga. Ove bolesti uključuju Parkinsonovu bolest, Alzheimerovu bolest i ASD3,4,18. Međutim, pristup moždanom tkivu za proučavanje ovih bolesti je otežan, posebno na mehanističkoj razini, što stanične modelne sustave čini nužnom alternativom. U ovoj studiji koristimo stanični modelni sustav koji koristi PPA-tretirane SH-SY5Y stanice kako bismo rekapitulirali mitohondrijsku disfunkciju uočenu kod neuronskih bolesti, posebno poremećaja iz autističnog spektra. Korištenje ovog PPA modela za proučavanje mitohondrijalne dinamike u neuronima može pružiti uvid u etiologiju ASD-a.
Istražili smo mogućnost korištenja TEM-a za pregled promjena u mitohondrijskoj morfologiji. Važno je napomenuti da se TEM mora pravilno koristiti kako bi se maksimizirala njegova učinkovitost. Priprema krio-uzoraka omogućuje bolje očuvanje neuronskih struktura istovremenim fiksiranjem staničnih komponenti i smanjenjem stvaranja artefakata34. U skladu s tim, primijetili smo da stanice SH-SY5Y slične neuronima imaju netaknute subcelularne organele i izdužene mitohondrije (slika 1a). To naglašava korisnost kriogenih tehnika pripreme za proučavanje mitohondrijske morfologije u modelima neuronskih stanica. Iako su kvantitativna mjerenja ključna za objektivnu analizu TEM podataka, još uvijek ne postoji konsenzus o tome koje specifične parametre treba mjeriti kako bi se potvrdile mitohondrijske morfološke promjene. Na temelju velikog broja studija koje su kvantitativno ispitale mitohondrijsku morfologiju17,31,32, razvili smo automatizirani cjevovod za analizu mitohondrijske slike koji mjeri osam morfoloških parametara, naime: površinu, površinu2, omjer stranica, opseg, kružnost, stupanj , Feretov promjer i zaobljenost.
Među njima, PPA je značajno smanjio površinu 2, površinu, perimetar i Feretov promjer (slika 1b-e). To je pokazalo da su mitohondriji postali manji i zaobljeniji, što je u skladu s prethodnim studijama koje su pokazale smanjenje površine mitohondrija nakon 72 sata mitohondrijskog stresa induciranog PPA30. Ove morfološke značajke mogu ukazivati ​​na mitohondrijsku fisiju, nužan proces za izdvajanje oštećenih komponenti iz mitohondrijske mreže kako bi se potaknula njihova razgradnja putem mitofagije35,36,37. S druge strane, smanjenje prosječne veličine mitohondrija može biti povezano s povećanom biogenezom, što rezultira stvaranjem malih nascentnih mitohondrija. Povećana fisija ili biogeneza predstavlja kompenzacijski odgovor za održavanje mitoze protiv mitohondrijskog stresa. Međutim, smanjeni rast mitohondrija, oštećena fuzija ili druga stanja ne mogu se isključiti.
Iako slike visoke rezolucije stvorene TEM-om omogućuju određivanje morfoloških karakteristika na razini pojedinačnih mitohondrija, ova metoda stvara dvodimenzionalne snimke u jednom trenutku. Kako bismo proučili dinamičke odgovore na metabolički stres, obojili smo mitohondrije s TMRE i koristili mikroskopiju s vremenskim prekidom i MEL analizom, koja omogućuje visokopropusnu 3D vizualizaciju promjena u mitohondrijskoj mreži tijekom vremena33,38. Uočili smo suptilne, ali značajne promjene u mitohondrijskoj dinamici pod PPA stresom (slika 2). Pri 3 mM, broj događaja fisije značajno se povećao, dok su događaji fuzije ostali isti kao u kontroli. Povećanje broja događaja fisije i fuzije uočeno je pri 5 mM PPA, ali te su promjene bile približno proporcionalne, što sugerira da kinetika fisije i fuzije doseže ravnotežu pri višim koncentracijama (slika 2b). Prosječni volumen mitohondrija ostao je nepromijenjen i pri 3 i pri 5 mM PPA, što ukazuje na to da je integritet mitohondrijske mreže očuvan (slika 2d). To odražava sposobnost dinamičkih mitohondrijskih mreža da reagiraju na blagi metabolički stres kako bi učinkovito održavale homeostazu bez uzrokovanja fragmentacije mreže. Pri 3 mM PPA, povećanje fisije je dovoljno za poticanje prijelaza u novu ravnotežu, ali je potrebno dublje kinetičko preoblikovanje kao odgovor na stres izazvan višim koncentracijama PPA.
Broj mitohondrija povećao se pri obje koncentracije stresa PPA, ali prosječni volumen mitohondrija nije se značajno promijenio (slika 2c). To može biti posljedica povećane biogeneze ili povećane diobe; međutim, u nedostatku značajnog smanjenja prosječnog volumena mitohondrija, vjerojatnije je da se biosinteza povećava. Međutim, podaci na slici 2 podržavaju postojanje dva kompenzacijska mehanizma: povećanje broja događaja fisije, što je u skladu s pojačanom regulacijom mitohondrijske fisije, i povećanje broja događaja, što je u skladu s mitohondrijskom biogenezom. U konačnici, dinamička kompenzacija za blagi stres može se sastojati od istovremenih procesa koji uključuju fisiju, fuziju, biogenezu i mitofagiju. Iako su prethodni autori pokazali da PPA pojačava mitozu30,39 i mitofagiju29, mi pružamo dokaze za preoblikovanje dinamike mitohondrijske fisije i fuzije kao odgovor na PPA. Ovi podaci potvrđuju morfološke promjene uočene TEM-om i pružaju daljnji uvid u mehanizme povezane s mitohondrijskom disfunkcijom izazvanom PPA.
Budući da ni TEM ni MEL analiza nisu pružile izravne dokaze o mehanizmima regulacije gena koji leže u osnovi uočenih morfoloških promjena, ispitali smo ekspresiju RNA gena uključenih u mitohondrijski metabolizam, biogenezu i dinamiku. Protoonkogen cMYC je transkripcijski faktor uključen u regulaciju mitohondrija, glikolize, metabolizma aminokiselina i masnih kiselina40. Osim toga, poznato je da cMYC regulira ekspresiju gotovo 600 mitohondrijskih gena uključenih u mitohondrijsku transkripciju, translaciju i sastavljanje kompleksa, uključujući NRF1 i TFAM41. NRF1 i TFAM su dva središnja regulatora mitoze, koji djeluju nizvodno od PGC-1α kako bi aktivirali replikaciju mtDNA. Ovaj put aktivira se signalizacijom cAMP i AMPK i osjetljiv je na potrošnju energije i metabolički stres. Također smo ispitali NFE2L2, redoks regulator mitohondrijske biogeneze, kako bismo utvrdili mogu li učinci PPA biti posredovani oksidativnim stresom.
Iako je ekspresija NFE2L2 ostala nepromijenjena, otkrili smo konzistentno smanjenje ekspresije cMYC, NRF1 i TFAM ovisno o dozi nakon 24 sata tretmana s 3 mM i 5 mM PPA (slika 3a-c). Smanjenje ekspresije cMYC prethodno je zabilježeno kao odgovor na mitohondrijski stres42, i obrnuto, smanjenje ekspresije cMYC može uzrokovati mitohondrijsku disfunkciju preoblikovanjem mitohondrijskog metabolizma, mrežne povezanosti i polarizacije membrane43. Zanimljivo je da je cMYC također uključen u regulaciju mitohondrijske fisije i fuzije42,43 i poznato je da povećava fosforilaciju DRP1 i lokalizaciju mitohondrija tijekom stanične diobe44, kao i da posreduje u mitohondrijskom morfološkom preoblikovanju u neuronskim matičnim stanicama45. Doista, fibroblasti s nedostatkom cMYC pokazuju smanjenu veličinu mitohondrija, što je u skladu s promjenama izazvanim stresom PPA43. Ovi podaci ilustriraju zanimljiv, ali još uvijek nejasan odnos između cMYC i mitohondrijske dinamike, pružajući zanimljivu metu za buduća istraživanja preoblikovanja izazvanog stresom PPA.
Smanjenje NRF1 i TFAM u skladu je s ulogom cMYC-a kao važnog transkripcijskog aktivatora. Ovi podaci također su u skladu s prethodnim studijama na stanicama raka debelog crijeva kod ljudi koje pokazuju da PPA smanjuje ekspresiju mRNA NRF1 nakon 22 sata, što je povezano s iscrpljivanjem ATP-a i povećanjem ROS46. Ti autori također su izvijestili da se ekspresija TFAM-a povećala nakon 8,5 sati, ali se vratila na početne razine nakon 22 sata. Nasuprot tome, Kim i sur. (2019.) pokazali su da je ekspresija mRNA TFAM-a značajno smanjena nakon 4 sata stresa PPA u stanicama SH-SY5Y; međutim, nakon 72 sata, ekspresija proteina TFAM značajno je povećana, a broj kopija mtDNA značajno je povećan. Dakle, smanjenje broja gena mitohondrijske biogeneze koje smo primijetili nakon 24 sata ne isključuje mogućnost da je povećanje broja mitohondrija povezano s aktivacijom biogeneze u ranijim vremenskim točkama. Prethodne studije su pokazale da PPA značajno pojačava PGC-1α mRNA i protein u SH-SY5Y stanicama nakon 4 sata i 30 minuta, dok propionska kiselina pojačava mitohondrijsku biogenezu u hepatocitima teladi putem PGC-1α nakon 12 sati i 39 minuta. Zanimljivo je da PGC-1α nije samo izravni transkripcijski regulator NRF1 i TFAM-a, već je također pokazano da regulira aktivnost MFN2 i DRP1 reguliranjem fisije i fuzije47. Uzevši sve u obzir, ovo naglašava blisku povezanost mehanizama koji reguliraju mitohondrijske kompenzacijske odgovore izazvane PPA. Štoviše, naši podaci odražavaju značajnu disregulaciju transkripcijske regulacije biogeneze i metabolizma pod stresom PPA.
Geni STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 i DRP1 spadaju među središnje regulatore mitohondrijske fisije, fuzije i dinamike37,48,49. Postoje mnogi drugi geni uključeni u mitohondrijsku dinamiku, međutim, prethodno je utvrđeno da su STOML2, OPA1 i MFN2 različito metilirani u kohortama ASD-a,16 a nekoliko neovisnih studija izvijestilo je o promjenama u tim transkripcijskim faktorima kao odgovor na mitohondrijski stres50,51.52. Ekspresija i OPA1 i STOML2 značajno je smanjena tretmanom s 3 mM i 5 mM PPA (slika 3e, f). OPA1 je jedan od klasičnih regulatora mitohondrijske fuzije putem izravne interakcije s MFN1 i 2 te igra ulogu u preoblikovanju krista i mitohondrijskoj morfologiji53. Točna uloga STOML2 u mitohondrijskoj dinamici ostaje nejasna, ali dokazi upućuju na to da igra ulogu u mitohondrijskoj fuziji, biogenezi i mitofagiji.
STOML2 je uključen u održavanje mitohondrijskog respiratornog spajanja i formiranje kompleksa respiratornog lanca54,55 te je pokazano da duboko mijenja metaboličke karakteristike stanica raka56. Studije su pokazale da STOML2 potiče potencijal mitohondrijske membrane i biogenezu putem interakcije s BAN-om i kardiolipinom 55, 57, 58. Osim toga, neovisne studije su pokazale da interakcija između STOML2 i PINK1 regulira mitofagiju59,60. Posebno je poznato da STOML2 izravno interagira s MFN2 i stabilizira ga, a također igra važnu ulogu u stabilizaciji dugih OPA1 izoformi inhibiranjem proteaze odgovorne za razgradnju OPA153,61,62. Smanjenje ekspresije STOML2 uočeno u PPA reakcijama može učiniti ove fuzijske proteine ​​podložnijima razgradnji putem putova ovisnih o ubikvitinu i proteasomima48. Iako precizna uloga STOML2 i OPA1 u dinamičkom odgovoru na PPA nije jasna, smanjena ekspresija ovih fuzijskih gena (Slika 3) može poremetiti ravnotežu između fisije i fuzije te dovesti do smanjenja veličine mitohondrija (Slika 3). 1).
S druge strane, ekspresija proteina OPA1 ostala je nepromijenjena nakon 24 sata, dok se razine mRNA i proteina MFN1, MFN2 ili DRP1 nisu značajno promijenile nakon tretmana PPA (slika 3g-i, slika 4). To može ukazivati ​​na to da nema promjena u regulaciji ovih čimbenika uključenih u mitohondrijsku fuziju i fisiju. Međutim, vrijedi napomenuti da je svaki od ova četiri gena također reguliran posttranskripcijskim modifikacijama (PTM) koje kontroliraju aktivnost proteina. OPA1 ima osam alternativnih varijanti splajsovanja koje se proteolitički cijepaju u mitohondrijima kako bi se proizvele dvije različite izoforme 63. Ravnoteža između dugih i kratkih izoformi u konačnici određuje ulogu OPA1 u mitohondrijskoj fuziji i održavanju mitohondrijske mreže64. Aktivnost DRP1 regulirana je fosforilacijom kalcij/kalmodulin-ovisne protein kinaze II (CaMKII), dok je razgradnja DRP1 regulirana ubikvitinacijom i SUMOilacijom65. Konačno, i DRP1 i MFN1/2 su GTPaze, tako da na aktivnost može utjecati brzina proizvodnje GTP-a u mitohondrijima 66. Stoga, iako ekspresija ovih proteina ostaje konstantna, to ne mora odražavati nepromijenjenu aktivnost ili lokalizaciju proteina 67,68. Doista, postojeći repertoari PTM proteina često služe kao prva linija obrane odgovorna za posredovanje akutnih stresnih odgovora. U prisutnosti umjerenog metaboličkog stresa u našem modelu, vjerojatno je da PTM potiče povećanu aktivnost fuzijskih i fisijskih proteina kako bi se dovoljno obnovio integritet mitohondrija bez potrebe za dodatnom aktivacijom ovih gena na razini mRNA ili proteina.
Uzeti zajedno, gore navedeni podaci ističu složenu i vremenski ovisnu regulaciju mitohondrijske morfologije i izazove razjašnjavanja tih mehanizama. Za proučavanje ekspresije gena prvo je potrebno identificirati specifične ciljne gene u signalnom putu. Međutim, naši podaci pokazuju da geni u istom putu ne reagiraju na isti način na isti stres. Zapravo, prethodne studije su pokazale da različiti geni u istom putu mogu pokazivati ​​različite vremenske profile odgovora30,46. Osim toga, postoje složeni posttranskripcijski mehanizmi koji narušavaju odnos između transkripcije i funkcije gena. Proteomske studije mogu pružiti uvid u utjecaj PTM-ova i funkcije proteina, ali također predstavljaju izazove, uključujući metode niskog protoka, visoke omjere signala i šuma te lošu rezoluciju.
U tom kontekstu, proučavanje mitohondrijske morfologije pomoću TEM-a i MEL-a ima veliki potencijal za rješavanje temeljnih pitanja o odnosu između mitohondrijske dinamike i funkcije te kako to utječe na bolest. Najvažnije je da TEM pruža izravnu metodu za mjerenje mitohondrijske morfologije kao konvergentne krajnje točke mitohondrijske disfunkcije i dinamike51. MEL također pruža izravnu metodu za vizualizaciju događaja fisije i fuzije u trodimenzionalnom staničnom okruženju, omogućujući kvantifikaciju dinamičkog mitohondrijskog remodeliranja čak i u odsutnosti promjena u ekspresiji gena33. Ovdje ističemo korisnost tehnika mitohondrijskog snimanja u sekundarnim mitohondrijskim bolestima. Ove bolesti obično karakterizira kronični blagi metabolički stres koji karakterizira suptilno remodeliranje mitohondrijskih mreža, a ne akutno mitohondrijsko oštećenje. Međutim, mitohondrijska kompenzacija potrebna za održavanje mitoze pod kroničnim stresom ima duboke funkcionalne posljedice. U kontekstu neuroznanosti, bolje razumijevanje ovih kompenzacijskih mehanizama može pružiti važne informacije o pleiotropnoj neuropatologiji povezanoj s mitohondrijskom disfunkcijom.
Konačno, naši podaci ističu korisnost tehnika snimanja za razumijevanje funkcionalnih posljedica složenih interakcija između ekspresije gena, modifikacija proteina i aktivnosti proteina koje kontroliraju dinamiku neuronskih mitohondrija. Koristili smo PPA za modeliranje mitohondrijske disfunkcije u modelu neuronskih stanica kako bismo dobili uvid u mitohondrijsku komponentu ASD-a. SH-SY5Y stanice tretirane PPA pokazale su promjene u mitohondrijskoj morfologiji: mitohondriji su postali mali i okrugli, a kriste su bile slabo definirane kada su promatrane TEM-om. MEL analiza pokazuje da se te promjene događaju istodobno s povećanjem događaja fisije i fuzije kako bi se održala mitohondrijska mreža kao odgovor na blagi metabolički stres. Štoviše, PPA značajno remeti transkripcijsku regulaciju mitohondrijskog metabolizma i homeostaze. Identificirali smo cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 i OPA1 kao ključne mitohondrijske regulatore poremećene PPA stresom i mogu igrati ulogu u posredovanju promjena u mitohondrijskoj morfologiji i funkciji izazvanih PPA. Potrebna su buduća istraživanja kako bi se bolje okarakterizirale PPA-inducirane vremenske promjene u ekspresiji gena i aktivnosti proteina, lokalizaciji i posttranslacijskim modifikacijama. Naši podaci ističu složenost i međuovisnost regulatornih mehanizama koji posreduju u odgovoru mitohondrijskog stresa i pokazuju korisnost TEM-a i drugih tehnika snimanja za ciljanije mehanističke studije.
Stanična linija SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) kupljena je od tvrtke Sigma-Aldrich. Stanice SH-SY5Y uzgajane su u Dulbeccoovom modificiranom Eagleovom mediju/smješavini hranjivih tvari F-12 (DMEM/F-12) i L-glutaminu (SC09411, ScienCell) u tikvicama od 25 cm2 nadopunjenim s 20% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) i 1% penicilina-streptomicina (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) na 37 °C, 5% CO2. Stanice su subkultivirane do 80% konfluencije korištenjem 0,05% tripsina-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugirane na 300 g i nasađene na gustoću od približno 7 × 105 stanica/ml. Svi eksperimenti provedeni su na nediferenciranim SH-SY5Y stanicama između pasaža 19-22. PPA se primjenjuje kao NaP. Otopiti NaP prah (CAS br. 137-40-6, kemijska formula C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) u toploj MilliQ vodi do koncentracije od 1 M i pohraniti na 4 °C. Na dan tretmana, razrijediti ovu otopinu s 1 M PPA do 3 mM i 5 mM PPA u mediju bez seruma (DMEM/F-12 s L-glutaminom). Koncentracije tretmana za sve eksperimente bile su bez PPA (0 mM, kontrola), 3 mM i 5 mM PPA. Eksperimenti su provedeni u najmanje tri biološka ponavljanja.
Stanice SH-SY5Y posijane su u tikvice od 25 cm5 brzinom od 5,5 × 105 stanica/ml i uzgajane 24 sata. PPA tretman dodan je u tikvicu prije 24 sata inkubacije. Sakupite pelete stanica slijedeći normalne protokole za subkulturu tkiva sisavaca (opisane gore). Resuspendirajte pelete stanica u 100 µl 2,5% glutaraldehida, 1× PBS i pohranite na 4 °C do obrade. Stanice SH-SY5Y kratko su centrifugirane kako bi se stanice peletirale i uklonilo 2,5% otopine glutaraldehida, 1× PBS. Resuspendirajte sediment u 4% agaroznom gelu pripremljenom u destiliranoj vodi (omjer volumena agaroze i sedimenta je 1:1). Komadići agaroze postavljeni su na rešetke na ravnim pločama i premazani 1-heksadecenom prije zamrzavanja pod visokim tlakom. Uzorci su zamrznuti u 100% suhom acetonu na -90 °C tijekom 24 sata. Temperatura je zatim povišena na -80 °C i dodana je otopina od 1 % osmijevog tetroksida i 0,1 % glutaraldehida. Uzorci su pohranjeni na -80 °C tijekom 24 sata. Nakon toga, temperatura je postupno povećavana do sobne temperature tijekom nekoliko dana: od – 80 °C do – 50 °C tijekom 24 sata, do – 30 °C tijekom 24 sata, do – 10 °C tijekom 24 sata i konačno do sobne temperature.
Nakon kriogene pripreme, uzorci su impregnirani smolom i napravljeni su ultratanki rezovi (∼100 nm) pomoću ultramikrotoma Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Rezovi su obojeni s 2%-tnim uranil acetatom i olovnim citratom. Uzorci su promatrani pomoću transmisijskog elektronskog mikroskopa FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (prije FEI), Eindhoven, Nizozemska) koji radi na 200 kV (Lab6 odašiljač) i Gatan CCD kamere (Gatan, UK) opremljene Tridiem energetskim filterom.
U svakoj tehničkoj replikaciji snimljeno je najmanje 24 slike pojedinačnih stanica, što je ukupno 266 slika. Sve slike su analizirane pomoću makroa Region of Interest (ROI) i makroa Mitochondria. Mitohondrijski makro temelji se na objavljenim metodama17,31,32 i omogućuje poluautomatsku skupnu obradu TEM slika u Fiji/ImageJ69. Ukratko: slika se invertira i invertira pomoću oduzimanja pozadine kotrljajuće kuglice (radijus od 60 piksela) i FFT propusnog filtera (koristeći gornju i donju granicu od 60 i 8 piksela) te supresije vertikalnih linija s tolerancijom orijentacije od 5%. Obrađena slika se automatski pragira pomoću algoritma maksimalne entropije i generira se binarna maska. Izdvojena su područja slike povezana s ručno odabranim ROI-ima u sirovim TEM slikama, karakterizirajući mitohondrije i isključujući plazma membranu i druga područja visokog kontrasta. Za svaki izdvojeni ROI analizirane su binarne čestice veće od 600 piksela, a površina čestice, opseg, glavna i sporedna os, Feretov promjer, zaobljenost i kružnost izmjereni su pomoću ugrađenih mjernih funkcija Fiji/ImageJ-a. Slijedeći Merrill, Flippo i Strack (2017), površina 2, omjer stranica čestice (omjer glavne i sporedne osi) i faktor oblika (FF) izračunati su iz tih podataka, gdje je FF = opseg 2/4pi x površina. Definicija parametarske formule može se pronaći u Merrill, Flippo i Strack (2017). Spomenuti makroi dostupni su na GitHubu (vidi Izjavu o dostupnosti podataka). U prosjeku je po PPA tretmanu analizirano približno 5600 čestica, za ukupno približno 17 000 čestica (podaci nisu prikazani).
Stanice SH-SH5Y stavljene su u zdjelice za kulture s 8 komora (ThermoFisher, #155411) kako bi se omogućila adhezija preko noći, a zatim inkubirane s TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) i Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Slike su dobivene korištenjem lasera od 405 nm i 561 nm tijekom 10 minuta, a sirove slike su dobivene kao z-stackovi koji sadrže 10 mikrografija slike s a-korakom od 0,2 μm između okvira slike u 12 uzastopnih vremenskih točaka. Slike su prikupljene korištenjem Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 platforme super-rezolucije (Carl Zeiss, Oberkochen, Njemačka) korištenjem LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 leće. Slike su analizirane u ImageJ-u korištenjem prethodno opisanog cjevovoda i ImageJ dodatka za mjerenje događaja fuzije i fisije, prosječnog broja mitohondrijskih struktura i prosječnog mitohondrijskog volumena po stanici33. MEL makroi dostupni su na GitHubu (vidi Izjavu o dostupnosti podataka).
Stanice SH-SY5Y uzgajane su u pločama sa šest jažica pri gustoći od 0,3 × 10⁶ stanica/mL tijekom 24 sata prije tretmana. RNA je ekstrahirana korištenjem Quick-RNA™ Miniprep protokola (ZR R1055, Zymo Research) s malim modifikacijama: doda se 300 μl pufera za lizu RNA u svaku jažicu prije uklanjanja i lizira se svaki uzorak kao završni korak s 30 μl vode bez DNase/RNase za eluaciju. Svi uzorci provjereni su na količinu i kvalitetu pomoću NanoDrop ND-1000 UV-Vis spektrofotometra. Ukupni protein iz staničnih lizata dobiven je korištenjem 200 μl RIPA pufera za lizu, a koncentracija proteina kvantificirana je korištenjem Bradford proteinskog testa70.
Sinteza cDNA provedena je korištenjem Tetro™ cDNA Synthesis Kit-a (BIO-65043, Meridian Bioscience) prema uputama proizvođača uz neke izmjene. cDNA je sintetizirana u reakcijama od 20 μl korištenjem 0,7 do 1 μg ukupne RNA. Primeri su odabrani iz prethodno objavljenih radova 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tablica S1), a prateće probe su dizajnirane korištenjem PrimerQuest alata tvrtke Integrated DNA Technologies. Svi geni od interesa normalizirani su na nuklearni B2M gen. Ekspresija gena STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC i OPA1 mjerena je RT-qPCR-om. Master mix je uključivao LUNA Taq polimerazu (M3003L, New England Biolabs), 10 μM početne i povratne primere, cDNA i vodu PCR kvalitete kako bi se dobio konačni volumen od 10 μL za svaku reakciju. Ekspresija gena diobe i fisije (DRP1, MFN1/2) mjerena je pomoću TaqMan multipleks testova. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) korišten je prema uputama proizvođača s manjim izmjenama. Multipleks RT-qPCR master mix uključuje 1X LUNA Taq polimerazu, 10 μM početne i povratne primere, 10 μM sondu, cDNA i vodu PCR kvalitete, što je rezultiralo konačnim volumenom od 20 μL za svaku reakciju. RT-qPCR proveden je pomoću Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - serijski broj: R0618110). Uvjeti ciklusa prikazani su u Tablici S1. Svi uzorci cDNA amplificirani su u tri primjerka, a standardna krivulja generirana je korištenjem niza desetostrukih razrjeđenja. Iz analize su uklonjene vrijednosti izvanrednih vrijednosti u tri primjerka s pragom standardne devijacije ciklusa (Ct) > 0,5 kako bi se osigurala ponovljivost podataka30,72. Relativna ekspresija gena izračunata je korištenjem metode 2-ΔΔCt79.
Uzorci proteina (60 μg) pomiješani su s Laemmlijevim puferom za punjenje u omjeru 2:1 i analizirani na 12%-tnom bezbojnom proteinskom gelu (Bio-Rad #1610184). Proteini su preneseni na PVDF (poliviniliden fluorid) membranu (#170-84156, Bio-Rad) pomoću Trans-Blot Turbo sustava (#170-4155, Bio-Rad). Membrana je blokirana i inkubirana s odgovarajućim primarnim antitijelima (OPA1, MFN1, MFN2 i DRP1) (razrijeđeno 1:1000) tijekom 48 sati, nakon čega je uslijedila inkubacija sa sekundarnim antitijelima (1:10 000) tijekom 1 sata. Membrane su zatim snimljene pomoću Clarity Western ECL supstrata (#170-5061, Bio-Rad) i snimljene pomoću Bio-Rad ChemiDoc MP sustava. Za Western blot analizu korišten je ImageLab verzija 6.1. Izvorni gel i blot prikazani su na slici S1. Informacije o antitijelima dane su u tablici S2.
Skupovi podataka prikazani su kao srednja vrijednost i standardna pogreška srednje vrijednosti (SEM) najmanje tri neovisna uzorka. Skupovi podataka testirani su na normalnost pomoću Shapiro-Wilksovog testa (osim ako nije drugačije navedeno) prije pretpostavke Gaussove distribucije i jednakih standardnih devijacija te nastavka analiza. Uz analizu skupa podataka, korišteni su Fisherova MEL LSD (p < 0,05), jednosmjerna ANOVA (srednja vrijednost tretmana u odnosu na kontrolu) i Dunnettov test višestruke usporedbe za određivanje značajnosti (p < 0,05). Značajne p vrijednosti prikazane su na grafu kao *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Sve statističke analize i grafovi provedeni su i generirani pomoću GraphPad Prism 9.4.0.
Fiji/ImageJ makroi za analizu TEM slika javno su dostupni na GitHubu: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro Mitochondrial Event Locator (MEL) javno je dostupan na GitHubu: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM i Vijaya A. Mitohondriji: glavni regulatori metabolizma, homeostaze, stresa, starenja i epigenetike. Indonezijski. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Višestruka mitohondrijska disfunkcija u shizofreniji, kompleks I kao moguća patološka meta. Shizofrenija. resurs. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. i Beal, MF Mitohondrijska disfunkcija kod Parkinsonove bolesti. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG i Mehta V. Stresni mitohondriji: mete invazije kod Alzheimerove bolesti. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF i Ferreira GK Mitohondriji i mozak: bioenergetika i više. Neurotoksini. resurs. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. i dr. Pleiotropni mitohondriji: utjecaj mitohondrija na razvoj neurona i bolesti. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. i Morais, VA Mitohondrijska biogeneza u neuronima: kako i gdje. međunarodnost. J. Mohr. znanost. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. i Zhao, J. Regulacija mitohondrijske dinamike sisavaca: prilike i izazovi. front. endokrini. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. i Slack, RS Mitohondrijska dinamika u regulaciji neurogeneze: od mozga u razvoju do odraslog mozga. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).