Sadašnjost *Trenutna adresa: Köln 50931, Njemačka, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
Neurodegeneracija mitohondrijskih bolesti smatra se nepovratnom jer je metabolička plastičnost neurona ograničena, ali učinak mitohondrijske disfunkcije na staničnu autonomiju neuronskog metabolizma u tijelu slabo je shvaćen. Ovdje predstavljamo stanično specifičan proteom Purkinjeovih neurona s progresivnim nedostatkom OXPHOS-a uzrokovanim poremećenom dinamikom mitohondrijske fuzije. Otkrili smo da je mitohondrijska disfunkcija izazvala duboku promjenu u području proteomike, što je u konačnici dovelo do sekvencijalne aktivacije preciznih metaboličkih programa prije stanične smrti. Neočekivano smo utvrdili očitu indukciju piruvat karboksilaze (PCx) i drugih enzima protiv starenja koji nadopunjuju međuprodukte TCA ciklusa. Inhibicija PCx pogoršala je oksidativni stres i neurodegeneraciju, što ukazuje na to da ateroskleroza ima zaštitni učinak u neuronima kojima nedostaje OXPHOS. Obnova mitohondrijske fuzije u terminalno degeneriranim neuronima potpuno poništava ove metaboličke karakteristike, čime se sprječava stanična smrt. Naši nalazi identificiraju prethodno nepoznate puteve koji daju otpornost mitohondrijskoj disfunkciji i pokazuju da se neurodegeneracija može poništiti čak i u kasnim fazama bolesti.
Središnja uloga mitohondrija u održavanju neuronskog energetskog metabolizma naglašena je opsežnim neurološkim simptomima povezanim s ljudskim mitohondrijskim bolestima. Većinu ovih bolesti uzrokuju genske mutacije koje reguliraju ekspresiju mitohondrijskih gena (1, 2) ili uništavanje gena povezano s mitohondrijskom dinamikom, što neizravno utječe na stabilnost mitohondrijske DNA (mtDNA) (3, 4). Rad na životinjskim modelima pokazao je da se kao odgovor na mitohondrijsku disfunkciju u okolnim tkivima mogu aktivirati konzervativni metabolički putevi (5-7), što pruža važne informacije za dubinsko razumijevanje patogeneze ovih složenih bolesti. Nasuprot tome, naše razumijevanje metaboličkih promjena specifičnih tipova stanica uzrokovanih općim neuspjehom u proizvodnji mitohondrijalnog adenozin trifosfata (ATP) u mozgu je temeljno (8), naglašavajući potrebu za identificiranjem terapijskih ciljeva koji se mogu koristiti za sprječavanje ili prevenciju bolesti. Spriječiti neurodegeneraciju (9). Nedostatak informacija je činjenica da se smatra da živčane stanice imaju vrlo ograničenu metaboličku fleksibilnost u usporedbi s tipovima stanica okolnih tkiva (10). S obzirom na to da ove stanice igraju središnju ulogu u koordinaciji opskrbe metabolitima neuronima kako bi se potaknuo sinaptički prijenos i odgovorilo na ozljede i bolesti, sposobnost prilagodbe staničnog metabolizma izazovnim uvjetima moždanog tkiva gotovo je ograničena na glialne stanice (11-14). Osim toga, inherentna stanična heterogenost moždanog tkiva uvelike ometa proučavanje metaboličkih promjena koje se javljaju u specifičnim neuronskim podskupinama. Kao rezultat toga, malo se zna o točnim staničnim i metaboličkim posljedicama mitohondrijske disfunkcije u neuronima.
Kako bismo razumjeli metaboličke posljedice mitohondrijske disfunkcije, izolirali smo Purkinjeove neurone (PN) u različitim fazama neurodegeneracije uzrokovane uništavanjem fuzije vanjske membrane mitohondrija (Mfn2). Iako su mutacije Mfn2 kod ljudi povezane s oblikom nasljedne motoričke senzorne neuropatije poznate kao Charcot-Marie-Tooth tip 2A (15), uvjetno uništavanje Mfn2 kod miševa je dobro poznata metoda indukcije oksidacijske fosforilacije (OXPHOS) disfunkcije. Različiti neuronski podtipovi (16-19) i rezultirajući neurodegenerativni fenotip popraćeni su progresivnim neurološkim simptomima, poput poremećaja kretanja (18, 19) ili cerebelarne ataksije (16). Korištenjem kombinacije kvantitativne (LFQ) proteomike bez označavanja, metabolomike, slikovnih i viroloških metoda, pokazujemo da progresivna neurodegeneracija snažno inducira piruvat karboksilazu (PCx) i druge čimbenike uključene u arteriosklerozu PN-ova in vivo. Ekspresija enzima. Kako bismo provjerili relevantnost ovog nalaza, specifično smo smanjili ekspresiju PCx u neuronuklearnim neuronima s nedostatkom Mfn2 i otkrili da ta operacija pogoršava oksidativni stres i ubrzava neurodegeneraciju, čime dokazujemo da azoospermija uzrokuje staničnu smrt i metaboličku prilagodljivost. Teška ekspresija MFN2 može potpuno spasiti terminalnu degenerativnu neuronuklearnu neuronukleozu s teškim nedostatkom OXPHOS-a, masivnom potrošnjom mitohondrijske DNA i očito prekinutom mitohondrijskom mrežom, što dodatno naglašava da se ovaj oblik neurodegeneracije može oporaviti čak i u uznapredovalom stadiju bolesti prije stanične smrti.
Kako bismo vizualizirali mitohondrije u PN-ima s izbačenim Mfn2 genom, koristili smo mišji soj koji omogućuje Cre-ovisnim mitohondrijama da ciljaju ekspresiju žutog fluorescentnog proteina (YFP) (mtYFP) (20) Cre i provjerili smo morfologiju mitohondrija in vivo. Otkrili smo da uništavanje gena Mfn2 u PN-ima dovodi do postupne diobe mitohondrijske mreže (slika S1A), a najranija promjena uočena je u dobi od 3 tjedna. Nasuprot tome, značajna degeneracija sloja staničnog tkiva PN-a, što je dokazano gubitkom imunobojenja kalbindinom, nije započela do dobi od 12 tjedana (slika 1, A i B). Vremenska neusklađenost između najranijih promjena u morfologiji mitohondrija i vidljivog početka neuronske smrti potaknula nas je da istražimo metaboličke promjene izazvane mitohondrijskom disfunkcijom prije stanične smrti. Razvili smo strategiju sortiranja stanica aktiviranih fluorescentnom aktivacijom (FACS) za izolaciju PN-a koji eksprimiraju YFP (YFP+) (Slika 1C), te u kontrolnim miševima (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: :L7-cre), u daljnjem tekstu CTRL (Slika S1B). Optimizacija strategije otvaranja na temelju relativnog intenziteta YFP signala omogućuje nam pročišćavanje YFP+ tijela (YFPhigh) PN-ova od ne-PN-ova (YFPneg) (Slika S1B) ili pretpostavljenih fluorescentnih aksonskih/dendritičnih fragmenata (YFPlow; Slika S1D, lijevo), što je potvrđeno konfokalnim mikroskopom (Slika S1D, desno). Kako bismo provjerili identitet klasificirane populacije, proveli smo LFQ proteomiku, a zatim analizu glavnih komponenti i otkrili da postoji jasna razlika između YFPhigh i YFPneg stanica (Slika S1C). YFPhigh stanice pokazale su neto obogaćenje poznatih PN markera (tj. Calb1, Pcp2, Grid2 i Itpr3) (21, 22), ali ne i obogaćenje proteina koji se obično eksprimiraju u neuronima ili drugim tipovima stanica (Slika 1D). Usporedba uzoraka u klasificiranim YFPhigh stanicama prikupljenim u neovisnim eksperimentima pokazala je koeficijent korelacije > 0,9, što pokazuje dobru ponovljivost između bioloških replikata (Slika S1E). Ukratko, ovi podaci potvrdili su naš plan za akutnu i specifičnu izolaciju izvedivih PN. Budući da korišteni L7-cre pogonski sustav inducira mozaičnu rekombinaciju u prvom tjednu nakon poroda (23), počeli smo izdvajati miševe iz CTRL-a i uvjetno (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) prikupljati neurone. Nakon što je rekombinacija završena, naziva se Mfn2cKO u dobi od 4 tjedna. Kao krajnju točku odabrali smo 8 tjedana starosti kada je PN sloj bio netaknut unatoč očiglednoj fragmentaciji mitohondrija (Slika 1B i Slika S1A). Ukupno smo kvantificirali ukupno 3013 proteina, od kojih je oko 22% bilo temeljeno na MitoCarta 2.0 anotacijama na temelju mitohondrijskog proteoma kao mitohondrija (Slika 1E) (Slika 1E) (24). Analiza diferencijalne ekspresije gena provedena u 8. tjednu pokazala je da je samo 10,5% svih proteina imalo značajne promjene (Slika 1F i Slika S1F), od kojih je 195 proteina bilo smanjeno, a 120 proteina pojačano (Slika 1F). Vrijedi napomenuti da „analiza inovativnog puta“ ovog skupa podataka pokazuje da različito eksprimirani geni uglavnom pripadaju ograničenom skupu specifičnih metaboličkih putova (Slika 1G). Zanimljivo je da, iako smanjenje regulacije putova povezanih s OXPHOS i kalcijevom signalizacijom potvrđuje indukciju mitohondrijske disfunkcije u pulmonalnim neuronima s nedostatkom fuzije, druge kategorije koje uglavnom uključuju metabolizam aminokiselina značajno su pojačane, što je u skladu s metabolizmom koji se događa u mitohondrijskim pulmonalnim neuronima. Rewiring je konzistentno.
(A) Reprezentativne konfokalne fotografije cerebelarnih presjeka CTRL i Mfn2cKO miševa koje pokazuju progresivni gubitak PN-ova (kalbindin, sivo); jezgre su kontrastno obojene s DAPI. (B) Kvantifikacija (A) (jednosmjerna analiza varijance, ***P<0,001; n = 4 do 6 krugova od tri miša). (C) Eksperimentalni tijek rada. (D) Raspodjela toplinske karte markera specifičnih za Purkinje (gore) i druge tipove stanica (sredina). (E) Vennov dijagram koji prikazuje broj mitohondrijskih proteina identificiranih u klasificiranoj PN. (F) Vulkanski dijagram različito eksprimiranih proteina u Mfn2cKO neuronima nakon 8 tjedana (granična vrijednost značajnosti od 1,3). (G) Analiza puta kreativnosti pokazuje pet najvažnijih puteva pojačane (crveno) i smanjene (plavo) regulacije u Mfn2cKO PN klasificiranoj kao 8 tjedana. Prikazana je prosječna razina ekspresije svakog detektiranog proteina. Toplinska karta u sivim tonovima: prilagođena P vrijednost. ns, nije važno.
Proteomski podaci pokazali su da se ekspresija proteina kompleksa I, III i IV postupno smanjivala. Kompleksi I, III i IV sadržavali su esencijalne podjedinice kodirane mtDNA, dok je kompleks II, koji je bio kodiran samo nuklearno, bio u osnovi nepromijenjen (Slika 2A i Slika S2A). U skladu s proteomskim rezultatima, imunohistokemija presjeka cerebelarnog tkiva pokazala je da se razina podjedinice MTCO1 (podjedinica 1 mitohondrijske citokrom C oksidaze) kompleksa IV u PN postupno smanjivala (Slika 2B). Podjedinica Mtatp8 kodirana mtDNA značajno je smanjena (Slika S2A), dok je razina podjedinice ATP sintaze kodirane nuklearno ostala nepromijenjena, što je u skladu s poznatim stabilnim kompleksom podsklopa ATP sintaze F1 kada je ekspresija mtDNA stabilna. Formiranje je konzistentno. Prekid (7). Evaluacija razine mtDNA u sortiranim Mfn2cKO PN-ovima pomoću lančane reakcije polimeraze u stvarnom vremenu (qPCR) potvrdila je postupno smanjenje broja kopija mtDNA. U usporedbi s kontrolnom skupinom, u dobi od 8 tjedana, zadržano je samo oko 20% razine mtDNK (Slika 2C). U skladu s tim rezultatima, bojenje Mfn2cKO PN-ova konfokalnom mikroskopijom korišteno je za detekciju DNK, pokazujući vremenski ovisnu potrošnju mitohondrijskih nukleotida (Slika 2D). Otkrili smo da su samo neki kandidati uključeni u razgradnju mitohondrijskih proteina i odgovor na stres bili pojačano regulirani, uključujući Lonp1, Afg3l2 i Clpx, te faktore sastavljanja kompleksa OXPHOS. Nisu otkrivene značajne promjene u razinama proteina uključenih u apoptozu (Slika S2B). Slično tome, otkrili smo da mitohondrijski i endoplazmatski retikulumski kanali uključeni u transport kalcija imaju samo manje promjene (Slika S2C). Osim toga, procjena proteina povezanih s autofagijom nije pronašla značajne promjene, što je u skladu s vidljivom indukcijom autofagosoma uočenom in vivo imunohistokemijom i elektronskom mikroskopijom (Slika S3). Međutim, progresivnu disfunkciju OXPHOS-a u PN-ovima prate očite ultrastrukturne mitohondrijske promjene. Mitohondrijski nakupine mogu se vidjeti u staničnim tijelima i dendritičkim stablima Mfn2cKO PN-ova starih 5 i 8 tjedana, a struktura unutarnje membrane pretrpjela je značajne promjene (Slika S4, A i B). U skladu s tim ultrastrukturnim promjenama i značajnim smanjenjem mtDNA, analiza akutnih cerebelarnih rezova s ​​tetrametilrodamin metil esterom (TMRM) pokazala je da je potencijal mitohondrijske membrane u Mfn2cKO PN-ovima značajno smanjen (Slika S4C).
(A) Vremenska analiza razine ekspresije OXPHOS kompleksa. Uzmite u obzir samo proteine ​​s P < 0,05 nakon 8 tjedana (dvosmjerna ANOVA). Isprekidana linija: Nema prilagodbe u usporedbi s CTRL. (B) Lijevo: Primjer cerebelarnog presjeka označenog anti-MTCO1 antitijelom (mjerna traka, 20 μm). Područje koje zauzimaju Purkinjeova stanična tijela prekriveno je žutom bojom. Desno: Kvantifikacija razina MTCO1 (jednosmjerna analiza varijance; n = 7 do 20 analiziranih stanica od tri miša). (C) qPCR analiza broja kopija mtDNA u sortiranoj PN (jednosmjerna analiza varijance; n = 3 do 7 miševa). (D) Lijevo: Primjer cerebelarnog presjeka označenog anti-DNA antitijelom (mjerna traka, 20 μm). Područje koje zauzimaju Purkinjeova stanična tijela prekriveno je žutom bojom. Desno: Kvantifikacija lezija mtDNA (jednosmjerna analiza varijance; n = 5 do 9 stanica od tri miša). (E) Primjer akutnog presjeka malog mozga koji prikazuje mitoYFP + Purkinjeove stanice (strelica) u snimci clamp metode cijelih stanica. (F) Kvantifikacija IV krivulje. (G) Reprezentativni zapisi injekcije depolarizirajuće struje u Purkinjeove stanice CTRL i Mfn2cKO. Gornji trag: Prvi puls koji je pokrenuo AP. Donji trag: Maksimalna frekvencija AP. (H) Kvantifikacija postsinaptičkih spontanih unosa (sPSP). Reprezentativni zapis i njegov omjer zumiranja prikazani su u (I). Jednosmjerna analiza varijance analizirala je n = 5 do 20 stanica od tri miša. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Reprezentativni zapisi spontane AP snimljene korištenjem perforiranog clamp moda. Gornji trag: Maksimalna frekvencija AP. Donji trag: zumiranje jedne AP. (K) Kvantificirajte prosječnu i maksimalnu frekvenciju AP prema (J). Mann-Whitneyjev test; n = 5 stanica analizirano je od četiri miša. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM; nije važno.
Očito oštećenje OXPHOS-a otkriveno je u 8 tjedana staroj Mfn2cKO PN, što ukazuje na to da je fiziološka funkcija neurona ozbiljno abnormalna. Stoga smo analizirali pasivne električne karakteristike neurona s nedostatkom OXPHOS-a u dobi od 4 do 5 tjedana i 7 do 8 tjedana provođenjem patch clamp snimanja cijelih stanica u akutnim cerebelarnim presjecima (Slika 2E). Neočekivano, prosječni membranski potencijal mirovanja i ulazni otpor Mfn2cKO neurona bili su slični kontroli, iako su postojale suptilne razlike između stanica (Tablica 1). Slično tome, u dobi od 4 do 5 tjedana nisu pronađene značajne promjene u odnosu struje i napona (IV krivulja) (Slika 2F). Međutim, nijedan Mfn2cKO neuron star 7 do 8 tjedana nije preživio IV režim (korak hiperpolarizacije), što ukazuje na to da postoji jasna osjetljivost na hiperpolarizacijski potencijal u ovoj kasnoj fazi. Nasuprot tome, u Mfn2cKO neuronima, depolarizirajuće struje koje uzrokuju ponavljajuća izbijanja akcijskog potencijala (AP) dobro se podnose, što ukazuje na to da se njihovi ukupni obrasci izbijanja ne razlikuju značajno od onih kod 8 tjedana starih kontrolnih neurona (Tablica 1 i Slika 2G). Slično tome, učestalost i amplituda spontanih postsinaptičkih struja (sPSC) bile su usporedive s onima u kontrolnoj skupini, a učestalost događaja povećala se s 4 tjedna na 5 tjedana na 7 tjedana na 8 tjedana sa sličnim povećanjem (Slika 2, H i I). Razdoblje sinaptičkog sazrijevanja u PN-ovima (25). Slični rezultati dobiveni su nakon perforiranih PN flastera. Ova konfiguracija sprječava moguću kompenzaciju defekata staničnih ATP-a, kao što bi se moglo dogoditi kod snimanja cjelovitih patch clamp patchova. Posebno, potencijal membrane u mirovanju i učestalost spontanog paljenja Mfn2cKO neurona nisu bili pogođeni (Slika 2, J i K). Ukratko, ovi rezultati pokazuju da se PN-ovi s očitom OXPHOS disfunkcijom mogu dobro nositi s visokofrekventnim obrascima pražnjenja, što ukazuje na to da postoji kompenzacijski mehanizam koji im omogućuje održavanje gotovo normalnih elektrofizioloških odgovora.
Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM (jednosmjerna analiza varijance, Holm-Sidakov test višestruke usporedbe; *P<0,05). Broj jedinice označen je zagradama.
Krenuli smo istražiti uključuje li bilo koja kategorija u proteomskom skupu podataka (Slika 1G) putove koji mogu suzbiti teški nedostatak OXPHOS-a, čime se objašnjava zašto zahvaćena PN može održati gotovo normalnu elektrofiziologiju (Slika 2, E do K). Proteomska analiza pokazala je da su enzimi uključeni u katabolizam aminokiselina razgranatog lanca (BCAA) značajno pojačano regulirani (Slika 3A i Slika S5A), a konačni produkt acetil-CoA (CoA) ili sukcinil CoA mogu nadopuniti trikarboksilate u ciklusu arteriosklerozne kiseline (TCA). Otkrili smo da se povećao sadržaj BCAA transaminaze 1 (BCAT1) i BCAT2. One kataliziraju prvi korak katabolizma BCAA stvaranjem glutamata iz α-ketoglutarata (26). Sve podjedinice koje čine kompleks ketokiselinske dehidrogenaze razgranatog lanca (BCKD) su pojačano regulirane (kompleks katalizira naknadnu i nepovratnu dekarboksilaciju rezultirajućeg ugljikovog kostura BCAA) (Slika 3A i Slika S5A). Međutim, nisu pronađene očite promjene u samoj BCAA u sortiranoj PN, što može biti posljedica povećanog staničnog unosa ovih esencijalnih aminokiselina ili korištenja drugih izvora (glukoze ili mliječne kiseline) za nadopunu TCA ciklusa (Slika S5B). PN-ovi kojima nedostaje OXPHOS također su pokazali povećanu aktivnost razgradnje i transaminacije glutamina u dobi od 8 tjedana, što se može odraziti pojačanom regulacijom mitohondrijskih enzima glutaminaze (GLS) i glutamin piruvat transaminaze 2 (GPT2) (Slika 3, A i C). Vrijedi napomenuti da je pojačana regulacija GLS ograničena na spojenu izoformu glutaminaze C (GLS-GAC) (promjena Mfn2cKO/CTRL je približno 4,5 puta veća, P = 0,05), a njezina specifična pojačana regulacija u tkivima raka može podržati mitohondrijsku bioenergiju. (27)
(A) Toplinska karta prikazuje promjenu razine proteina za određeni put nakon 8 tjedana. (B) Primjer cerebelarnog presjeka označenog anti-PCx antitijelom (mjerna traka, 20 μm). Žuta strelica pokazuje na tijelo Purkinjeovih stanica. (C) Analiza ekspresije proteina u vremenu identificirana kao važan kandidat za aterosklerozu (višestruki t-test, *FDR <5%; n = 3-5 miševa). (D) Gore: Shematski dijagram koji prikazuje različite načine ulaska označenog ugljika sadržanog u tragaču [1-13C]piruvat (tj. putem PDH ili transarterijskog puta). Dolje: Grafikon violine prikazuje postotak jednostruko označenog ugljika (M1) pretvorenog u asparaginsku kiselinu, limunsku kiselinu i jabučnu kiselinu nakon označavanja akutnih cerebelarnih presjeka s [1-13C]piruvatom (parni t-test; ** P <0,01). (E) Sveobuhvatna analiza vremenskog tijeka naznačenog puta. Uzmite u obzir samo proteine ​​s P <0,05 u 8 tjedana. Isprekidana linija: nema vrijednosti prilagodbe (dvosmjerna analiza varijance; * P <0,05; *** P <0,001). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM.
U našoj analizi, katabolizam BCAA postao je jedan od ključnih puteva povećane regulacije. Ova činjenica snažno sugerira da se volumen ventilacije koji ulazi u ciklus TCA može promijeniti u neuronskim stanicama kojima nedostaje OXPHOS. To može predstavljati glavni oblik neuronskog metaboličkog preoblikovanja, što može imati izravan utjecaj na neuronsku fiziologiju i preživljavanje tijekom održavanja teške OXPHOS disfunkcije. U skladu s ovom hipotezom, otkrili smo da je glavni antiaterosklerotski enzim PCx pojačano reguliran (Mfn2cKO/CTRL se mijenja približno 1,5 puta; Slika 3A), što katalizira pretvorbu piruvata u oksaloacetat (28), za koji se vjeruje da se nalazi u moždanom tkivu. Ekspresija je ograničena na astrocite (29, 30). U skladu s rezultatima proteomike, konfokalna mikroskopija pokazala je da je ekspresija PCx specifično i značajno povećana u neuronskim stanicama kojima nedostaje OXPHOS, dok je reaktivnost PCx uglavnom bila ograničena na susjedne Bergmannove glialne stanice kontrole (Slika 3B). Kako bismo funkcionalno testirali uočenu pojačanu regulaciju PCx, tretirali smo akutne cerebelarne kriške s [1-13C]piruvatnim traserom. Kada je piruvat dehidrogenaza (PDH) oksidirala piruvat, njegova izotopska oznaka je nestala, ali se ugrađuje u međuprodukte TCA ciklusa kada se piruvat metabolizira vaskularnim reakcijama (Slika 3D). U prilog našim proteomskim podacima, uočili smo veliki broj markera iz ovog trasera u asparaginskoj kiselini kriški Mfn2cKO, dok su limunska i jabučna kiselina također imale umjeren trend, iako ne značajan (Slika 3D).
U dopaminskim neuronima MitoPark miševa s mitohondrijskom disfunkcijom uzrokovanom dopaminskim neuronima koji specifično uništavaju gen mitohondrijskog transkripcijskog faktora A (Tfam) (slika S6B), ekspresija PCx također je bila značajno povišena (31), što ukazuje na acetonsku kiselinu kao arteriosklerozu. Pojava bolesti regulirana je tijekom disfunkcije neuronskog OXPHOS-a u tijelu. Vrijedi napomenuti da je otkriveno da su jedinstveni enzimi (32-34) koji se mogu eksprimirati u neuronima koji mogu biti povezani s arteriosklerozom značajno povišeni u neuronima kojima nedostaje OXPHOS, kao što su propionil-CoA karboksilaza (PCC-A), malonil-CoA pretvara propionil-CoA u sukcinil-CoA i mitohondrijski jabučni enzim 3 (ME3), čija je glavna uloga oporavak piruvata iz malata (slika 3, A i C) (33, 35). Osim toga, otkrili smo značajan porast enzima Pdk3, koji fosforilira i time inaktivira PDH (36), dok nisu otkrivene promjene u enzimu Pdp1 koji aktivira PDH ili samom kompleksu enzima PDH (Slika 3A). Dosljedno, u Mern2cKO PN-ima, fosforilacija α1 podjedinice α (PDHE1α) podjedinice piruvat dehidrogenaze E1 komponente PDH kompleksa u Ser293 (poznato da inhibira enzimsku aktivnost PDH) bila je pojačana (Slika S6C) (Slika S6C). Piruvat nema vaskularni pristup.
Konačno, otkrili smo da su superput biosinteze serina i glicina, povezani mitohondrijski ciklus folata (1C) i biosinteza prolina (slika 1G i slika S5C) značajno pojačani, prema izvješćima, tijekom procesa aktivacije. Okolna tkiva se aktiviraju s mitohondrijskom disfunkcijom (5-7). Konfokalna analiza koja podržava ove proteomske podatke pokazala je da su u PN s nedostatkom OXPHOS-a, cerebelarni rezovi miševa starih 8 tjedana bili podvrgnuti serin hidroksimetiltransferazi 2 (SHMT2), ključnom enzimu mitohondrijskog ciklusa folata. Značajan imunološki odgovor (slika S5D). U 13 akutnih cerebelarnih rezova inkubiranih s CU-glukozom, eksperimenti metaboličkog praćenja dodatno su potvrdili pojačanu regulaciju biosinteze serina i prolina, što ukazuje na povećanje fluksa ugljikovih izoformi u serin i prolin (slika S5E). Budući da su reakcije koje potiču GLS i GPT2 odgovorne za sintezu glutamata iz glutamina i transaminaciju između glutamata i α-ketoglutarata, njihova pojačana regulacija ukazuje na to da neuroni s nedostatkom OXPHOS-a imaju povećanu potrebu za glutamatom. To može biti usmjereno na održavanje povećane biosinteze prolina (slika S5C). Za razliku od tih promjena, proteomska analiza cerebelarnih astrocita iz PN-specifičnih Mfn2cKO miševa pokazala je da se ovi putevi (uključujući sve antiperoksidaze) nisu značajno promijenili u ekspresiji, što pokazuje da je ovo metaboličko preusmjeravanje selektivno za degradirani PN (slika S6, D do G).
Ukratko, ove analize otkrile su značajno različite obrasce vremenske aktivacije specifičnih metaboličkih putova u neuronskim neuronima. Iako abnormalna neuronska mitohondrijska funkcija može dovesti do rane ateroskleroze i preoblikovanja 1C (slika 3E i slika S5C), pa čak i predvidljivih promjena u ekspresiji I i IV kompleksa, promjene u de novo sintezi serina su tek postale očite u kasnim fazama. OXPHOS disfunkcija (slika 3E i slika S5C). Ovi nalazi definiraju sekvencijalni proces u kojem stresom inducirani mitohondrijski (1C ciklus) i citoplazmatski (biosinteza serina) odgovori sinergistički s porastom ateroskleroze u TCA ciklusu kako bi preoblikovali neuronski metabolizam.
8 tjedana stare OXPHOS-deficitne PN stanice mogu održavati aktivnost visokofrekventne ekscitacije i podvrgnuti se značajnom metaboličkom ponovnom povezivanju kako bi kompenzirale mitohondrijsku disfunkciju. Ovo otkriće otvara zanimljivu mogućnost da čak i u ovom trenutku ove stanice mogu primiti terapijsku intervenciju kako bi se odgodila ili spriječila neurodegeneracija. Kasno. Ovu mogućnost smo riješili kroz dvije neovisne intervencije. U prvoj metodi dizajnirali smo vektor Cre-ovisnog adeno-asociiranog virusa (AAV) tako da se MFN2 može selektivno eksprimirati u OXPHOS-deficitnim PN stanicama in vivo (slika S7A). AAV koji kodira MFN2 i fluorescentni reporterski gen mCherry (Mfn2-AAV) verificirani su u primarnim neuronskim kulturama in vitro, što je uzrokovalo ekspresiju MFN2 na Cre-ovisan način i spasilo mitohondrijsku morfologiju, čime se spriječila neuromutacija u Mfn2cKO neuronima (slika S7, B, D i E). Zatim smo proveli in vivo eksperimente stereotaktičke isporuke 8 tjedana starog Mfn2-AAV u cerebelarni korteks Mfn2cKO i kontrolnih miševa te analizirali 12 tjedana stare miševe (Slika 4A). Tretirani Mfn2cKO miševi su uginuli (Slika 1, A i B) (16). Virusna transdukcija in vivo rezultirala je selektivnom ekspresijom PN-a u nekim cerebelarnim krugovima (Slika S7, G i H). Injekcija kontrolnog AAV-a koji eksprimira samo mCherry (Ctrl-AAV) nije imala značajan utjecaj na stupanj neurodegeneracije u Mfn2cKO životinja. Nasuprot tome, analiza Mfn2cKO transduciranih s Mfn2-AAV pokazala je značajan zaštitni učinak staničnog sloja PN-a (Slika 4, B i C). Posebno se čini da je gustoća neurona gotovo nerazlučiva od kontrolnih životinja (Slika 4, B i C te Slika S7, H i I). Ekspresija MFN1, ali ne i MFN2, jednako je učinkovita u sprječavanju neuronske smrti (Slika 4C i Slika S7, C i F), što ukazuje na to da ekspresija ektopičnog MFN1 može učinkovito nadoknaditi nedostatak MFN2. Daljnja analiza na razini jedne PN pokazala je da je Mfn2-AAV uvelike spasio ultrastrukturu mitohondrija, normalizirao razinu mtDNA i preokrenuo visoku ekspresiju markera antiangiogeneze PCx ​​(Slika 4, C do E). Vizualni pregled spašenih Mfn2cKO miševa u stanju mirovanja pokazao je da su im se poboljšali postura i motorički simptomi (pokret S1 do S3). Zaključno, ovi eksperimenti pokazuju da je odgođeno ponovno uvođenje MFN2 u PN-ove s teškim deficitom OXPHOS-a dovoljno za preokretanje potrošnje mtDNA i induciranje ateroskleroze, čime se sprječava degeneracija aksona i neuronska smrt in vivo.
(A) Shema koja prikazuje eksperimentalni raspored za injektiranje AAV-a koji kodira MFN2 kada je aktiviran naznačeni metabolički put. (B) Reprezentativne konfokalne slike 12 tjedana starih cerebelarnih rezova transduciranih u 8 tjedana kod Mfn2cKO miševa i označenih anti-kalbindin antitijelom. Desno: Skaliranje aksonskih vlakana. Skala zumiranja aksona je 450 i 75 μm. (C) Lijevo: Kvantifikacija gustoće Purkinjeovih stanica u AAV transdukcijskoj petlji (AAV+) (jednosmjerna analiza varijance; n = 3 miša). Desno: analiza fokusa mtDNA u transduciranoj PN u 12. tjednu (nespareni t-test; n = 6 stanica od tri miša). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Reprezentativne transmisijske elektronske mikrografije PN-ova Mfn2cKO cerebelarnih rezova transduciranih naznačenim virusnim vektorima. Ružičasta maska ​​prikazuje područje koje zauzimaju dendriti, a žuti isprekidani kvadrat prikazuje zumiranje s desne strane; n predstavlja jezgru. Mjerilo, 1 μm. (E) prikazuje primjer PCx ​​bojenja u PN transduciranom nakon 12 tjedana. Mjerilo, 20 μm. OE, prekomjerna ekspresija; FC, promjena struka.
Konačno, istražili smo važnost preživljavanja stanica induciranih peroksidazom u PN-ima koji su iskusili OXPHOS disfunkciju. Generirali smo mCherry koji kodira AAV-shRNA (RNA kratkih ukosnica) specifično ciljajući mišju PCx mRNA (AAV-shPCx) i injektirali virus ili njegovu pomiješanu kontrolu (AAV-scr) u mali mozak Mfn2cKO miševa. Injekcija je provedena u četvrtom tjednu starosti (Slika 5A) kako bi se postiglo učinkovito smanjenje PCx-a tijekom razdoblja kada je ekspresija PCx porasla (Slika 3C), a sloj PN stanica još uvijek bio netaknut (Slika 1A). Vrijedi napomenuti da smanjenje PCx-a (Slika S8A) dovodi do značajnog ubrzanja PN smrti, koja je ograničena na zaraženi prsten (Slika 5, B i C). Kako bismo razumjeli mehanizam metaboličkih učinaka izazvanih pojačanom regulacijom PCx, proučavali smo redoks status PN-ova nakon što su PCx ​​knockdown i AAV-posredovani optički biosenzor Grx1-roGFP2 istovremeno eksprimirani (Slika S8, B do D) kako bismo procijenili relativnu promjenu redoks potencijala peptida glutationa (38). Zatim smo proveli dvofotonsku fluorescentnu slikovnu mikroskopiju tijekom cijelog života (FLIM) u akutnim presjecima mozga 7 tjedana starih Mfn2cKO ili kontrolnih jedinki iz legla kako bismo otkrili potencijalne promjene u citoplazmatskom redoks statusu nakon provjere FLIM uvjeta (Slika S8, E do G). Analiza je pokazala značajno povećanje oksidacijskog stanja pojedinačnih Mfn2cKO PN-ova kojima nedostaje ekspresija PCx, što se razlikuje od kontrolnih neurona ili Mfn2cKO PN-ova koji eksprimiraju samo izmiješanu shRNA (Slika 5, D i E). Kada je ekspresija PCx smanjena, postotak Mfn2cKO PN-ova koji pokazuju visoko oksidirano stanje povećao se za više od tri puta (Slika 5E), što ukazuje da je pojačana regulacija PCx održala redoks kapacitet degeneriranih neurona.
(A) Shema koja prikazuje eksperimentalni raspored za injektiranje AAV-a koji kodira shPCx kada je aktiviran naznačeni metabolički put. (B) Reprezentativne konfokalne fotografije 8 tjedana starih cerebelarnih presjeka u Mfn2cKO miševa transduciranih i obilježenih anti-kalcineurinskim antitijelom nakon 4 tjedna. Mjerilo, 450 μm. (C) Kvantifikacija gustoće Purkinjeovih stanica u AAV-transduciranim petljama (jednosmjerna analiza varijance; n = 3 do 4 miša). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM; ***P < 0,001. (D) Reprezentativna FLIM slika prikazuje prosječni životni vijek 7 tjedana starih PN-a koji eksprimiraju glutationski redoks senzor Grx1-roGFP2 pod određenim eksperimentalnim uvjetima. LUT (look-up table) omjer: vremenski interval preživljavanja (u pikosekundama). Mjerilo, 25 μm. (E) Histogram prikazuje raspodjelu vrijednosti životnog vijeka Grx1-roGFP2 iz (D) (n=158 do 368 stanica u dva miša pod svakim uvjetom). Kružni dijagram iznad svakog histograma: prikazuje broj stanica sa značajno duljim (crvena, oksidirana) ili kraćim (plava, smanjena) vrijednostima životnog vijeka, koje prelaze 1 SD prosječne vrijednosti životnog vijeka u CTRL-AAV-scr. (F) Predloženi model pokazuje zaštitni učinak pojačane regulacije neuronskog PCx-a.
Sve u svemu, podaci koje ovdje pružamo pokazuju da ponovna ekspresija MFN2 može u potpunosti spasiti uznapredovalu PN s teškim nedostatkom OXPHOS-a, teškim iscrpljivanjem mtDNA i izrazito abnormalnom ista-sličnom morfologijom, čime se osigurava kontinuirani napredak čak i kod uznapredovalih bolesti. Neurodegeneracija pruža reverzibilne dokaze o stadiju prije stanične smrti. Ovaj stupanj metaboličke fleksibilnosti dodatno je naglašen sposobnošću neurona da induciraju aterosklerozu (ponovno ožičenje TCA ciklusa), što inhibira ekspresiju PCx u PN-ima kojima nedostaje OXPHOS i pojačava staničnu smrt, čime igra zaštitnu ulogu (Slika 5F).
U ovoj studiji pružili smo dokaze da je odgovor neurona (PN) na disfunkciju OXPHOS-a postupna konvergencija prema aterosklerozi TCA ciklusa putem diferencijalnog aktivacijskog puta aktiviranog metaboličkim programima. Proteomsku analizu potvrdili smo mnogim komplementarnim metodama i otkrili da, kada su izazvani teškom mitohondrijskom disfunkcijom, neuroni imaju prethodno nepoznat oblik metaboličke elastičnosti. Na naše iznenađenje, cijeli proces ponovnog ožičenja ne označava nužno terminalno metaboličko stanje koje postupno i nepovratno prati neurodegeneraciju, ali naši podaci sugeriraju da on može predstavljati neuron održavanja čak i u fazi prije stanične smrti. Mehanizam funkcionalne kompenzacije. Ovo otkriće ukazuje na to da neuroni imaju znatan stupanj metaboličke plastičnosti u tijelu. Ta činjenica dokazuje da kasnije ponovno uvođenje MFN2 može preokrenuti ekspresiju ključnih metaboličkih markera i spriječiti degeneraciju PN-a. Naprotiv, inhibira aterosklerozu i ubrzava živce. transseksualac.
Jedan od najfascinantnijih nalaza u našem istraživanju jest da PN-ovi kojima nedostaje OXPHOS mogu modificirati metabolizam TCA ciklusa pojačavanjem enzima koji specifično stimuliraju arteriosklerozu. Metaboličko preuređenje uobičajena je značajka stanica raka, od kojih se neke oslanjaju na glutamin kao nadopunu međuproduktima TCA ciklusa za proizvodnju redukcijskih ekvivalenata, koji pokreću respiratorni lanac i održavaju proizvodnju prekursora biosinteze lipida i nukleotida (39, 40). Nedavna studija pokazala je da je u perifernim tkivima koja doživljavaju disfunkciju OXPHOS-a ponovno povezivanje metabolizma glutamina/glutamata također istaknuta značajka (5, 41), gdje smjer ulaska glutamina u TCA ciklus ovisi o težini OXPHOS ozljede (41). Međutim, nedostaju jasni dokazi o bilo kakvoj sličnosti neuronske metaboličke plastičnosti u tijelu i njezinoj mogućoj relevantnosti u kontekstu bolesti. U nedavnoj in vitro studiji pokazano je da primarni kortikalni neuroni mobiliziraju skupove glutamata za neurotransmisiju, čime potiču oksidativni metabolizam i aterosklerozu u uvjetima metaboličkog stresa (42). Vrijedi napomenuti da se pod farmakološkom inhibicijom enzima sukcinat dehidrogenaze TCA ciklusa, smatra da karboksilacija piruvata održava sintezu oksaloacetata u kultiviranim neuronima cerebelarnih granula (34). Međutim, fiziološka relevantnost ovih mehanizama za moždano tkivo (gdje se vjeruje da je ateroskleroza uglavnom ograničena na astrocite) i dalje ima važno fiziološko značenje (43). U ovom slučaju, naši podaci pokazuju da se PN oštećeni OXPHOS-om u tijelu mogu prebaciti na razgradnju BCAA i karboksilaciju piruvata, što su dva glavna izvora suplementacije međuprodukata TCA fonda. Iako je predložen navodni doprinos katabolizma BCAA metabolizmu neuronske energije, uz ulogu glutamata i GABA za neurotransmisiju (44), još uvijek nema dokaza za ove mehanizme in vivo. Stoga je lako nagađati da disfunkcionalni PN-ovi mogu automatski kompenzirati potrošnju međuprodukata TCA potaknutu procesom asimilacije povećanjem ateroskleroze. Posebno, pojačana regulacija PCx može biti potrebna za održavanje povećane potražnje za asparaginskom kiselinom, što se sugerira u proliferirajućim stanicama s mitohondrijskom disfunkcijom (45). Međutim, naša metabolomska analiza nije otkrila nikakve značajne promjene u razini asparaginske kiseline u stabilnom stanju u Mfn2cKO PN-ima (slika S6A), što vjerojatno odražava različitu metaboličku iskorištavanje asparaginske kiseline između proliferirajućih stanica i postmitotičkih neurona. Iako točan mehanizam pojačane regulacije PCx u disfunkcionalnim neuronima in vivo tek treba biti okarakteriziran, pokazali smo da ovaj preuranjeni odgovor igra važnu ulogu u održavanju redoks stanja neurona, što je dokazano u FLIM eksperimentima na cerebelarnim rezovima. Posebno, sprječavanje PN-ova da pojačano reguliraju PCx može dovesti do oksidiranijeg stanja i ubrzati staničnu smrt. Aktivacija razgradnje BCAA i karboksilacija piruvata nisu načini za karakterizaciju perifernih tkiva mitohondrijske disfunkcije (7). Stoga se čini da su prioritetna značajka neurona s nedostatkom OXPHOS-a, čak i ako ne i jedina značajka, koja je važna za neurodegeneraciju. .
Cerebelarna bolest je heterogeni tip neurodegenerativne bolesti koja se obično manifestira kao ataksija i često oštećuje PN (46). Ova populacija neurona je posebno osjetljiva na mitohondrijsku disfunkciju jer je njihova selektivna degeneracija kod miševa dovoljna za reprodukciju mnogih motoričkih simptoma koji karakteriziraju ljudsku spinocerebelarnu ataksiju (16, 47, 48). Prema izvješćima, transgeni mišji model s mutiranim genom povezan je s ljudskom spinocerebelarnom ataksijom i ima mitohondrijsku disfunkciju (49, 50), što naglašava važnost proučavanja posljedica nedostatka OXPHOS-a kod PNPH. Stoga je posebno prikladno učinkovito izolirati i proučavati ovu jedinstvenu populaciju neurona. Međutim, s obzirom na to da su PN vrlo osjetljive na pritisak i čine mali udio ukupne populacije cerebelarnih stanica, za mnoge omik studije, selektivno odvajanje istih kao cijelih stanica još uvijek je izazovan aspekt. Iako je gotovo nemoguće postići apsolutni nedostatak kontaminacije drugih tipova stanica (posebno tkiva odraslih), kombinirali smo učinkovit korak disocijacije s FACS-om kako bismo dobili dovoljan broj održivih neurona za nizvodnu proteomsku analizu i imali prilično visoku pokrivenost proteinima (oko 3000 proteina) u usporedbi s postojećim skupom podataka o cijelom malom mozgu (51). Očuvanjem održivosti cijelih stanica, metoda koju ovdje pružamo omogućuje nam ne samo provjeru promjena u metaboličkim putovima u mitohondrijima, već i provjeru promjena u njihovim citoplazmatskim ekvivalentima, što nadopunjuje upotrebu oznaka mitohondrijske membrane za obogaćivanje tipa stanica. Nova metoda za broj mitohondrija u složenim tkivima (52, 53). Metoda koju opisujemo nije povezana samo s proučavanjem Purkinjeovih stanica, već se može lako primijeniti na bilo koju vrstu stanice kako bi se riješile metaboličke promjene u oboljelim mozgovima, uključujući i druge modele mitohondrijske disfunkcije.
Konačno, identificirali smo terapijski prozor tijekom ovog procesa metaboličkog preuređenja koji može potpuno preokrenuti ključne znakove staničnog stresa i spriječiti neuronsku degeneraciju. Stoga, razumijevanje funkcionalnih implikacija ovdje opisanog preoblikovanja može pružiti temeljne uvide u moguće tretmane za održavanje neuronske održivosti tijekom mitohondrijske disfunkcije. Potrebna su buduća istraživanja usmjerena na analizu promjena u energetskom metabolizmu u drugim tipovima moždanih stanica kako bi se u potpunosti otkrila primjenjivost ovog principa na druge neurološke bolesti.
MitoPark miševi su prethodno opisani (31). C57BL/6N miševi s loxP koji okružuju Mfn2 gene prethodno su opisani (18) i križani s L7-Cre miševima (23). Dobiveni dvostruko heterozigotni potomci zatim su križani s homozigotnim Mfn2loxP/Mfn2loxP miševima kako bi se generirali Purkinje-specifični nokauti gena za Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). U podskupini parenja, alel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) uveden je dodatnim križanjima (20). Svi postupci na životinjama provedeni su u skladu s europskim, nacionalnim i institucionalnim smjernicama te odobreni od strane LandesamtfürNatur of Umwelt i Verbraucherschutz, Sjeverna Rajna-Vestfalija, Njemačka. Rad na životinjama također slijedi smjernice Europske federacije udruženja za laboratorijske znanosti o životinjama.
Nakon anestezije cervikalne dislokacije trudnice, izoliran je mišji embrij (E13). Korteks je diseciran u Hanksovoj uravnoteženoj otopini soli (HBSS) nadopunjenoj s 10 mM Hepesa i stavljen na Dulbeccoov modificirani Eagleov medij koji sadrži papain (20 U/ml) i cistein (1μg/ml). Tkivo je inkubirano u DMEM-u (1 ml) i disocirano enzimskom digestijom na 37°C tijekom 20 minuta, a zatim mehanički samljeveno u DMEM-u nadopunjenom s 10% fetalnog goveđeg seruma. Stanice su posijane na pokrovna stakalca premazana polilizinom u gustoći od 2×10⁶ po zdjelici za kulturu od 6 cm ili u gustoći od 0,5×10⁶ stanica/cm² za slikovnu analizu. Nakon 4 sata, medij je zamijenjen Neurobazalnim medijem bez seruma koji sadrži 1% dodatka B27 i 0,5 mM GlutaMaxa. Neuroni su zatim održavani na 37°C i 5% CO2 tijekom cijelog eksperimenta te su hranjeni jednom tjedno. Kako bi se inducirala rekombinacija in vitro, 3 μl (zdjelica s 24 jažice) ili 0,5 μl (pločica s 24 jažice) sljedećeg vektora virusa AAV9 korišteno je za tretiranje neurona drugog dana in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, kataloški broj 105530-AAV9) i AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, kataloški broj 105545-AAV9).
Komplementarna DNA mišjeg Mfn1 i Mfn2 (dobivena iz Addgene plazmida #23212 i #23213) označena je V5 sekvencom (GKPIPNPLLGLDST) na C-terminusu i spojena je s mCherry u okviru preko T2A sekvence. Grx1-roGFP2 je dar od Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Zamjenom tdTomato kasete konvencionalnim metodama kloniranja, kaseta je subklonirana u pAAV-CAG-FLEX-tdTomato okosnicu (Addgene referentni broj 28306) kako bi se generirali vektori pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 i pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Slična strategija korištena je za generiranje kontrolnog vektora pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Za generiranje AAV-shPCx konstrukta potreban je plazmidni AAV vektor (VectorBuilder, pAAV [shRNA]-CMV-mCherry-U6-mPcx-[shRNA#1]) koji sadrži DNA sekvencu koja kodira shRNA usmjerenu na mišji PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Pod kontrolom U6 promotora, koristi se mCherry pod kontrolom CMV promotora. Proizvodnja pomoćnih AAV vektora provedena je prema uputama proizvođača (Cell Biolabs). Ukratko, koristite transfer plazmid koji nosi mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) prolazno transfekciju 293AAV stanica - T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ili Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodirajući gen, kao i kodirajući AAV1 kapsidni protein i pomoćni protein. Plazmid za pakiranje, metodom kalcijevog fosfata. Sirovi virusni supernatant dobiven je ciklusima smrzavanja i odmrzavanja u kupelji suhog leda/etanola i liziranim stanicama u fosfatno puferiranoj otopini soli (PBS). Vektor AAV pročišćen je diskontinuiranom ultracentrifugacijom s gradijentom jodiksanola (24 sata pri 32 000 okretaja u minuti i 4 °C) i koncentriran pomoću centrifugalnog filtera Amicon ultra-15. Genomski titar AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 kopija genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX određen je kako je prethodno opisano (54), mjeren kvantitativnom PCR-om u stvarnom vremenu (qPCR)-MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) i AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Primarni neuroni su sastrugani u ledeno hladnom 1x PBS-u, peletirani, a zatim homogenizirani u 0,5% Triton X-100 / 0,5% natrijevom deoksiholatu/PBS puferu za lizu koji sadrži fosfatazu i inhibitor proteaze (Roche). Kvantifikacija proteina provedena je korištenjem testa s bicinhoninskom kiselinom (Thermo Fisher Scientific). Proteini su zatim odvojeni SDS-poliakrilamidnom gel elektroforezom, a zatim blotirani na poliviniliden fluoridnu membranu (GE Healthcare). Blokirajte nespecifična mjesta i inkubirajte s primarnim antitijelom (vidi Tablicu S1 za detalje) u 5% mlijeku u TBST-u (Tris-puferirana fiziološka otopina s Tweenom), koraci ispiranja i sekundarno antitijelo u TBST inkubaciji. Inkubirajte s primarnim antitijelom preko noći na +4°C. Nakon ispiranja, nanesite sekundarno antitijelo 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon toga, inkubacijom istog blota s anti-β-aktinskim antitijelom, potvrđeno je isto punjenje. Detekcija pretvaranjem u kemiluminiscenciju i pojačavanjem kemiluminiscencije (GE Healthcare).
Neuroni prethodno posijani na pokrovna stakalca fiksirani su s 4% paraformaldehida (PFA)/PBS-a u određenom vremenskom trenutku na sobnoj temperaturi tijekom 10 minuta. Pokrivna stakalca su prvo permeirana s 0,1% Triton X-100/PBS-a tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim u blokirajućem puferu [3% goveđi serumski albumin (BSA)/PBS]. Drugog dana, pokrovna stakalca su isprana blokirajućim puferom i inkubirana s odgovarajućim sekundarnim antitijelom konjugiranim s fluoroforom tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi; na kraju, uzorci su temeljito isprani u PBS-u s 4',6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI), kontrastno obojeni i zatim fiksirani na mikroskopsko stakalce s Aqua-Poly/Mount.
Miševi (muški i ženski) anestezirani su intraperitonealnom injekcijom ketamina (130 mg/kg) i ksilazina (10 mg/kg) te im je potkožno dan analgetik karprofen (5 mg/kg). Nakon toga, smješteni su u stereotaktički instrument (Kopf) opremljen toplim jastučićem. Lubanja se otkrije i zubnom bušilicom se stanji dio cerebelarne kore koji odgovara mis kosti (od lambda: rep 1,8, lateralno 1, što odgovara lobuli IV i V). Zakrivljenom iglom šprice pažljivo se napravi mala rupa u lubanji kako se ne bi poremetila vaskularna mreža ispod. Zatim se tanka staklena kapilara polako umetne u mikro-rupu (od -1,3 do -1 na ventralnoj strani dura mater), a 200 do 300 nl AAV-a se ubrizgava u mikro-injektor (Narishige) ručnim špricama (Narishige) nekoliko puta pod niskim tlakom tijekom vremenskog razdoblja od 10 do 20 minuta. Nakon infuzije, kapilaru stavite još 10 minuta kako bi se virus potpuno proširio. Nakon što se kapilare povuku, koža se pažljivo zašije kako bi se smanjila upala rane i omogućio oporavak životinje. Životinje su liječene analgeticima (kaspofen) nekoliko dana nakon operacije, tijekom kojih je njihovo fizičko stanje pažljivo praćeno, a zatim su eutanazirane u navedenom vremenskom trenutku. Svi postupci provedeni su u skladu s europskim, nacionalnim i institucionalnim smjernicama te ih je odobrio LandesamtfürNatur of Umwelt end Verbraucherschutz, Sjeverna Rajna-Vestfalija, Njemačka.
Životinje su anestezirane ketaminom (100 mg/kg) i ksilazinom (10 mg/kg), a srce je prvo perfuzirano s 0,1 M PBS-om, a zatim s 4% PFA u PBS-u. Tkivo je disecirano i fiksirano u 4% PFA/PBS-u preko noći na 4°C. Za pripremu sagitalnih presjeka (debljine 50 μm) s fiksiranog mozga u PBS-u korišten je vibrirajući nož (Leica Microsystems GmbH, Beč, Austrija). Osim ako nije drugačije navedeno, bojenje slobodno plutajućih presjeka provedeno je kako je gore opisano (13) na sobnoj temperaturi i miješanju. Ukratko, prvo su dobiveni rezovi permeabilizirani s 0,5% Triton X-100/PBS-om tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi; za neke epitope (Pcx i Shmt2), zagrijavanjem rezova 25 minuta u tris-EDTA puferu na 80°C (pH 9) umjesto ovog koraka. Zatim su sekcije inkubirane s primarnim antitijelom (vidi Tablicu S1) u puferu za blokiranje (3% BSA/PBS) na 4°C preko noći uz miješanje. Sljedećeg dana, sekcije su isprane puferom za blokiranje i inkubirane s odgovarajućim sekundarnim antitijelom konjugiranim s fluoroforom tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi; na kraju su sekcije temeljito isprane u PBS-u, kontrastno obojene s DAPI-jem, a zatim fiksirane s AquaPolymount na mikroskopskom predmetnom stakalcu.
Za snimanje uzorka korišten je laserski skenirajući konfokalni mikroskop (TCS SP8-X ili TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) opremljen bijelim laserom i ultraljubičastim laserom od 405 dioda. Pobuđivanjem fluorofora i prikupljanjem signala hibridnim detektorom (HyDs), korišten je LAS-X softver za prikupljanje složenih slika u skladu s Nyquistovim uzorkovanjem u sekvencijalnom načinu rada: za nekvantitativne panele, to su visoko dinamički signali (na primjer, u somatskim stanicama i dendritima) (mtYFP). Koristite HyD za detekciju broja PN-ova u BrightR načinu rada). Primjenjuje se usklađivanje od 0,3 do 6 ns za smanjenje pozadine.
Snimanje sortiranih stanica u stvarnom vremenu. Nakon sortiranja u Neurobasal-A mediju koji sadrži 1% dodatka B27 i 0,5 mM GlutaMaxa, stanice su odmah posijane na staklene pločice obložene poli-l-lizinom (μ-Slide8 Well, Ibidi, kataloški broj 80826), a zatim su držane na 37°C i 5% CO2 tijekom 1 sata kako bi se stanice slegle. Snimanje u stvarnom vremenu provedeno je na Leica SP8 laserskom skenirajućem konfokalnom mikroskopu opremljenom bijelim laserom, HyD-om, uljnim objektivom s 63×[1,4 numeričkom aperturom (NA)] i grijaćim postoljem.
Miš je brzo anesteziran ugljikovim dioksidom i dekapitiran, mozak je brzo uklonjen iz lubanje i izrezan na sagitalni presjek debljine 200 μm (za eksperiment označavanja 13C) ili 275 μm debljine (za eksperimente s dva fotona) ispunjen sljedećim materijalima. Sladoled (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Njemačka) napunjen je sljedećim tvarima: 125 mM ledeno hladna, ugljikom zasićena (95% O2 i 5% CO2) umjetna cerebrospinalna tekućina (ACSF) s niskim udjelom Ca2 + NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijevog fosfatnog pufera, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukoza, 0,5 mM CaCl2 i 3,5 mM MgCl2 (osmotski tlak od 310 do 330 mmol). Dobivene rezove mozga prebacite u komoru za prethodnu inkubaciju koja sadrži viši Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijevog fosfatnog pufera, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoze, 1,0 mM CaCl2 i 2,0 mM MgCl2) medij) pH 7,4 i 310 do 320 mmol).
Tijekom procesa snimanja, presjeci su premješteni u namjensku prostoriju za snimanje, a eksperiment je proveden pod kontinuiranom perfuzijom ACSF-a na konstantnoj temperaturi od 32° do 33°C. Za snimanje presjeka korišten je multifotonski laserski skenirajući mikroskop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) opremljen objektivom Leica 25x (NA 0,95, voda) i Ti:safirni laser (Chameleon Vision II, Coherent). FLIM modul (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Promjene u citoplazmatskom redoks stanju PN-ova mjerene su dvofotonskim FLIM-om u sagitalnim presjecima mozga, gdje je biosenzor Grx1-roGFP2 ciljao PN-ove. U PN sloju, polje akvizicije odabrano je oko 50 do 80 μm ispod površine presjeka kako bi se osiguralo da postoji održiv PN (tj. nedostatak zrnaste strukture ili neuronskih morfoloških promjena duž dendrita) te dvostruko pozitivni roGFP2 senzor i AAV koji kodiraju shRNA PCx ili njezinu kontrolnu sekvencu (svaki koeksprimira mCherry). Prikupljaju se slike jednog slaganja s 2x digitalnim zumom [valna duljina pobuđivanja: 890 nm; 512 nm 512 piksela]. Detekcija: interni HyD, fluorescein izotiocijanat (FITC) filterska skupina] i usrednjavanje slike unutar 2 do 3 minute koriste se kako bi se osiguralo da se prikupi dovoljno fotona (ukupno 1000 fotona) za prilagođavanje krivulje. Osjetljivost Grx1-roGFP2 sonde i provjera FLIM uvjeta provedene su praćenjem vrijednosti životnog vijeka roGFP2 pri dodavanju egzogenih 10 mM H2O2 u perfuzijski ACSF (kako bi se maksimizirala oksidacija, što rezultira povećanim životnim vijekom), a zatim dodavanjem 2 mM ditiotreitola (minimizira stupanj redukcije, što rezultira smanjenjem životnog vijeka) (Slika S8, D do G). Za analizu dobivenih rezultata upotrijebite softver FLIMfit 5.1.1, prilagodite jednu eksponencijalnu krivulju raspada cijele slike izmjerenom IRF-u (funkcija odziva instrumenta), a χ2 je približno 1. Za izračun životnog vijeka jednog PN-a, maska ​​oko tijela živca ručno je nacrtana, a prosječni životni vijek u svakoj maski korišten je za kvantifikaciju.
Analiza mitohondrijalnog potencijala. Nakon što je akutni dio inkubiran sa 100 nM TMRM-a izravno dodanog u perfuzirani ACSF tijekom 30 minuta, promjene mitohondrijskog potencijala PN-ova izmjerene su dvofotonskim mikroskopom. TMRM snimanje provedeno je pobuđivanjem sonde na 920 nm i korištenjem internog HyD-a (tetrametilrodamin izotiocijanat: 585/40 nm) za prikupljanje signala; korištenjem iste valne duljine pobuđivanja, ali korištenjem drugog internog HyD-a (FITC: 525/50) za snimanje mtYFP-a. Koristite ImageJ-ov dodatak Image Calculator za procjenu mitohondrijskog potencijala na razini pojedinačne stanice. Ukratko, jednadžba dodatka: signal = min (mtYFP, TMRM) koristi se za identifikaciju mitohondrijske regije koja prikazuje TMRM signal u Purkinje Somaliju u konfokalnoj slici s jednim slojem odgovarajućeg kanala. Zatim se kvantificira površina piksela u rezultirajućoj maski, a zatim normalizira na odgovarajućoj pragovoj jednoslojnoj slici mtYFP kanala kako bi se dobila mitohondrijska frakcija koja prikazuje mitohondrijski potencijal.
Slika je dekonvoluirana pomoću Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) softvera. Za skenirane slike pločica, montaža jedne pločice napravljena je pomoću algoritma za automatsko spajanje koji pruža LAS-X softver. Nakon kalibracije slike, koristite ImageJ i Adobe Photoshop za daljnju obradu slike i jednoliko podešavanje svjetline i kontrasta. Za grafičku pripremu koristite Adobe Illustrator.
Analiza fokusa mtDNA. Broj lezija mtDNA kvantificiran je na cerebelarnim presjecima označenim antitijelima protiv DNA pomoću konfokalnog mikroskopa. Svako ciljno područje stvoreno je za tijelo stanice i jezgru svake stanice, a odgovarajuće područje izračunato je pomoću dodatka Multi Measure (softver ImageJ). Oduzmite površinu jezgre od površine tijela stanice kako biste dobili citoplazmatsku površinu. Konačno, dodatak Analyze Particles (softver ImageJ) korišten je za automatsku kvantifikaciju citoplazmatskih točaka DNA koje ukazuju na mtDNA na slici praga, a dobiveni rezultati normalizirani su na PN prosjek CTRL miševa. Rezultati su izraženi kao prosječan broj nukleozida po stanici.
Analiza ekspresije proteina. Koristite ImageJ-ov dodatak Image Calculator za procjenu ekspresije proteina u PN na razini pojedinačne stanice. Ukratko, u jednoslojnoj konfokalnoj slici odgovarajućeg kanala, pomoću jednadžbe: signal = min (mtYFP, antitijelo), identificira se mitohondrijsko područje koje pokazuje imunoreaktivnost na određeno antitijelo u Purkini. Zatim se kvantificira područje piksela u rezultirajućoj maski, a zatim normalizira na odgovarajućoj pragovoj jednostrukoj slici mtYFP kanala kako bi se dobila mitohondrijska frakcija prikazanog proteina.
Analiza gustoće Purkinjeovih stanica. Dodatak Cell Counter programa ImageJ korišten je za procjenu gustoće Purkinjeovih stanica dijeljenjem broja prebrojanih Purkinjeovih stanica s duljinom cerebelarnog prstena koji zauzimaju prebrojane stanice.
Priprema i prikupljanje uzoraka. Mozgovi kontrolne skupine i miševa Mfn2cKO fiksirani su u 2% PFA/2,5% glutaraldehida u 0,1 M fosfatnom puferu (PB), a zatim su pripremljeni koronalni rezovi pomoću cilijata (Leica Mikrosysteme GmbH, Beč, Austrija) (debljina 50 do 60 μm). Zatim su fiksirani u PB puferu u 1% tetraoksidu i 1,5% kalijevom ferocijanidu na sobnoj temperaturi tijekom 1 sata. Rezovi su tri puta isprani destiliranom vodom, a zatim obojeni 70% etanolom koji sadrži 1% uranil acetata tijekom 20 minuta. Rezovi su zatim dehidrirani u graduiranom alkoholu i ugrađeni u epoksidnu smolu Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, kataloški broj 14040) između staklenih pločica obloženih silikonom, te konačno polimerizirani u pećnici tijekom 48 sati na 60°C. Odabrano je područje cerebelarne kore i ultratanki rezovi debljine 50 nm izrezani su na Leica Ultracutu (Leica Mikrosysteme GmbH, Beč, Austrija) i uhvaćeni na bakrenoj mreži s prorezima 2×1 mm obloženoj polistirenskim filmom. Rezovi su obojeni otopinom 4%-tnog uranil acetata u H2O tijekom 10 minuta, isprani s H2O nekoliko puta, zatim s Reynoldsovim olovnim citratom u H2O tijekom 10 minuta, a potom isprani s H2O nekoliko puta. Mikrografije su snimljene transmisijskim elektronskim mikroskopom Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) korištenjem digitalne kamere TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, SAD). Njemačka).
Kod miševa zaraženih AAV-om, mozak je odvojen i narezan na sagitalni presjek debljine 1 mm, a mali mozak je pregledan fluorescentnim mikroskopom kako bi se identificirao prsten zaražen AAV-om (tj. onaj koji eksprimira mCherry). Korišteni su samo eksperimenti u kojima injekcija AAV-a rezultira vrlo visokom učinkovitošću transdukcije sloja Purkinjeovih stanica (tj. gotovo cijelog sloja) u najmanje dva uzastopna cerebelarna prstena. Petlja transducirana AAV-om je mikrodisekirana za noćnu postfiksaciju (4% PFA i 2,5% glutaraldehida u 0,1 M kokoatnom puferu) i dalje obrađena. Za ugradnju EPON-a, fiksirano tkivo je isprano s 0,1 M natrijevog kokoatnog pufera (Applichem) i inkubirano s 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) u 0,1 M natrijevog kokoatnog pufera (Applichem) 4 sata, a zatim isprano 2 sata. Ponovite 3 puta s 0,1 M kokamidnog pufera. Nakon toga, uzlazni niz etanola korišten je za inkubaciju svake otopine etanola na 4°C tijekom 15 minuta kako bi se tkivo dehidriralo. Tkivo je preneseno u propilen oksid i inkubirano preko noći u EPON-u (Sigma-Aldrich) na 4°C. Tkivo je stavljeno u svježi EPON na sobnoj temperaturi tijekom 2 sata, a zatim uronjeno u 62°C tijekom 72 sata. Upotrijebljen je ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) i dijamantni nož (Diatome, Biel, Švicarska) za rezanje ultratankih rezova od 70 nm, te obojeno s 1,5% uranil acetatom tijekom 15 minuta na 37°C, te obojeno otopinom olovnog citrata 4 minute. Elektronske mikrografije snimljene su pomoću JEM-2100 Plus transmisijskog elektronskog mikroskopa (JEOL) opremljenog Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) i softverom DigitalMicrograph (Gatan). Za analizu, elektronske mikrografije snimljene su s digitalnim zumom od 5000× ili 10 000×.
Morfološka analiza mitohondrija. Za sve analize, konture pojedinačnih mitohondrija ručno su ocrtane na digitalnim slikama pomoću softvera ImageJ. Analizirani su različiti morfološki parametri. Gustoća mitohondrija izražena je kao postotak dobiven dijeljenjem ukupne površine mitohondrija svake stanice s površinom citoplazme (površina citoplazme = površina stanice - površina jezgre stanice) × 100. Okruglost mitohondrija izračunata je formulom [4π∙(površina/perimetar 2)]. Analizirana je morfologija mitohondrija i podijeljena u dvije kategorije („tubularni“ i „mjehurićasti“) prema njihovim glavnim oblicima.
Analiza broja i gustoće autofagosoma/lizosoma. Pomoću softvera ImageJ ručno ocrtajte konture svakog autofagosoma/lizosoma na digitalnoj slici. Površina autofagosoma/lizosoma izražena je kao postotak izračunat dijeljenjem ukupne površine strukture autofagosoma/lizosoma svake stanice s površinom citoplazme (površina citoplazme = površina stanice - površina jezgre) × 100. Gustoća autofagosoma/lizosoma izračunava se dijeljenjem ukupnog broja s brojem struktura autofagosoma/lizosoma po stanici (u smislu površine citoplazme) (površina citoplazme = površina stanice - površina jezgre).
Označavanje za akutno seciranje i pripremu uzorka. Za eksperimente koji zahtijevaju označavanje glukozom, prenesite akutne rezove mozga u komoru za prethodnu inkubaciju koja sadrži zasićeni ugljik (95% O2 i 5% CO2), visoki Ca2+ ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijevog fosfatnog pufera, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoze, 1,0 mM CaCl2 i 2,0 mM MgCl2, pH podešen na 7,4 i 310 do 320 mOsm), u kojoj je glukoza 13C6- glukozna supstitucija (Eurisotop, kataloški broj CLM-1396). Za eksperimente koji zahtijevaju označavanje piruvatom, prenesite akutne rezove mozga u viši Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijev fosfatni pufer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoza, 1,0 mM CaCl2 i dodajte 2,0 mM MgCl2, podesite pH na 7,4 i 310 do 320 mOsm) i dodajte 1 mM 1-[1-13C]piruvata (Eurisotop, kataloški broj CLM-1082). Inkubirajte rezove 90 minuta na 37°C. Na kraju eksperimenta, rezovi su brzo isprani vodenom otopinom (pH 7,4) koja sadrži 75 mM amonijevog karbonata, a zatim homogenizirani u 40:40:20 (v:v:v) acetonitril (ACN):metanol:voda. Nakon što su sekcije inkubirane na ledu 30 minuta, uzorci su centrifugirani pri 21 000 g tijekom 10 minuta na 4 °C, a bistri supernatant je osušen u SpeedVac koncentratoru. Dobiveni osušeni talog metabolita pohranjen je na -80 °C do analize.
Analiza aminokiselina obilježenih s 13C tekućinskom kromatografijom i masenom spektrometrijom. Za analizu tekućinskom kromatografijom i masenom spektrometrijom (LC-MS), talog metabolita resuspendiran je u 75 μl vode LC-MS kvalitete (Honeywell). Nakon centrifugiranja pri 21 000 g tijekom 5 minuta na 4 °C, 20 μl pročišćenog supernatanta korišteno je za analizu protoka aminokiselina, dok je ostatak ekstrakta odmah korišten za analizu aniona (vidi dolje). Analiza aminokiselina provedena je korištenjem prethodno opisanog protokola derivatizacije benzoil klorida (55, 56). U prvom koraku, 10 μl 100 mM natrijevog karbonata (Sigma-Aldrich) dodano je u 20 μl ekstrakta metabolita, a zatim je 10 μl 2%-tnog benzoil klorida (Sigma-Aldrich) dodano u ACN LC kvalitete. Uzorak je kratko vrtložen, a zatim centrifugiran pri 21 000 g tijekom 5 minuta na 20 °C. Prebacite bistri supernatant u bočicu za autosampler od 2 ml s konusnim staklenim umetkom (volumen 200 μl). Uzorci su analizirani pomoću Acquity iClass LC sustava ultra visokih performansi (Waters) spojenog na Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) precizni maseni spektrometar visoke rezolucije (Thermo Fisher Scientific). Za analizu je 2 μl derivatiziranog uzorka ubrizgano u kolonu T3 silicijevog dioksida visoke čvrstoće dimenzija 100 × 1,0 mm (Waters) koja sadrži čestice veličine 1,8 μm. Brzina protoka je 100 μl/min, a puferski sustav sastoji se od pufera A (10 mM amonijev format i 0,15% mravlja kiselina u vodi) i pufera B (ACN). Gradijent je sljedeći: 0%B u 0 minuta; 0%B. 0 do 15% B u 0 do 0,1 minuta; 15 do 17% B u 0,1 do 0,5 minuta; B od 17 do 55% u 0,5 do 14 minuta; B od 55 do 70% u 14 do 14,5 minuta; od 14,5 do 70 do 100% B u 18 minuta; 100% B u 18 do 19 minuta; 100 do 0% B u 19 do 19,1 minuta; 0% B u 19,1 do 28 minuta (55, 56). QE-HF maseni spektrometar radi u načinu pozitivne ionizacije s rasponom mase m/z (omjer mase/naboja) od 50 do 750. Primijenjena rezolucija je 60 000, a dobivena ciljana iona s kontrolom pojačanja (AGC) je 3 × 106, a maksimalno vrijeme iona je 100 milisekundi. Izvor zagrijane elektroraspršivačke ionizacije (ESI) radi pri naponu raspršivanja od 3,5 kV, temperaturi kapilare od 250 °C, protoku zraka kroz plašt od 60 AU (proizvoljnih jedinica) i pomoćnom protoku zraka od 20 AU. 250 °C. Leća S postavljena je na 60 AU.
Analiza organskih kiselina obilježenih s 13C metodom anionske kromatografije-MS. Preostali talog metabolita (55 μl) analiziran je pomoću Dionex ionskog kromatografskog sustava (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) spojenog na QE-HF maseni spektrometar (Thermo Fisher Scientific). Ukratko, 5 μl ekstrakta metabolita ubrizgano je u Dionex IonPac AS11-HC kolonu opremljenu HPLC-om (2 mm × 250 mm, veličina čestica 4 μm, Thermo Fisher Scientific) u načinu rada s djelomičnom petljom s omjerom punjenja od 1. ) Dionex IonPac AG11-HC zaštitna kolona (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Temperatura kolone održava se na 30 °C, a automatski uzorkivač je postavljen na 6 °C. Koristite uložak kalijevog hidroksida s deioniziranom vodom za stvaranje gradijenta kalijevog hidroksida kroz generator eluenta. Odvajanje metabolita pri brzini protoka od 380 μl/min, primjenom sljedećeg gradijenta: 0 do 3 minute, 10 mM KOH; 3 do 12 minuta, 10 do 50 mM KOH; 12 do 19 minuta, 50 do 100 mM KOH; 19 do 21 minuta, 100 mM KOH; 21 do 21,5 minuta, 100 do 10 mM KOH. Kolona je ponovno uravnotežena pod 10 mM KOH tijekom 8,5 minuta.
Eluirani metaboliti se nakon kolone kombiniraju s dodatnim protokom izopropanola od 150 μl/min, a zatim se usmjeravaju u maseni spektrometar visoke rezolucije koji radi u načinu rada negativne ionizacije. MS prati raspon mase od m/z 50 do 750 s rezolucijom od 60 000. AGC je postavljen na 1 × 106, a maksimalno vrijeme iona održava se na 100 ms. Zagrijani ESI izvor radio je na naponu raspršivanja od 3,5 kV. Ostale postavke ionskog izvora su sljedeće: temperatura kapilare 275 °C; protok plina plašta, 60 AU; protok pomoćnog plina, 20 AU na 300 °C i postavka S leće na 60 AU.
Analiza podataka metabolita obilježenih s 13C. Za analizu podataka omjera izotopa upotrijebite softver TraceFinder (verzija 4.2, Thermo Fisher Scientific). Identitet svakog spoja provjeren je pouzdanim referentnim spojem i neovisno analiziran. Kako bi se provela analiza obogaćivanja izotopa, površina ekstrahiranog ionskog kromatograma (XIC) svakog izotopa 13C (Mn) ekstrahirana je iz [M + H] +, gdje je n broj ugljika ciljanog spoja, koji se koristi za analizu aminokiselina ili [MH] + koji se koristi za analizu aniona. Točnost mase XIC-a je manja od pet dijelova na milijun, a točnost RT je 0,05 minuta. Analiza obogaćivanja provodi se izračunavanjem omjera svakog detektiranog izotopa prema zbroju svih izotopa odgovarajućeg spoja. Ovi omjeri dani su kao postotne vrijednosti za svaki izotop, a rezultati su izraženi kao molarni postotak obogaćivanja (MPE), kao što je prethodno opisano (42).
Smrznuti neuronski talog homogeniziran je u ledeno hladnom 80%-tnom metanolu (v/v), vrtložen i inkubiran na -20°C tijekom 30 minuta. Uzorak ponovno vrtložno miješajte i miješajte na +4°C tijekom 30 minuta. Uzorak je centrifugiran na 21 000 g tijekom 5 minuta na 4°C, a zatim je dobiveni supernatant sakupljen i osušen pomoću SpeedVac koncentratora na 25°C za naknadnu analizu. Kao što je gore opisano, LC-MS analiza provedena je na aminokiselinama sortiranih stanica. Korištenjem TraceFindera (verzija 4.2, Thermo Fisher Scientific), analiza podataka provedena je korištenjem monoizotopske mase svakog spoja. Kvantilna normalizacija podataka o metabolitima provedena je korištenjem softverskog paketa preprocessCore (57).
Priprema kriški. Miš je brzo anesteziran ugljikovim dioksidom i dekapitiran, mozak je brzo uklonjen iz lubanje, a vibrirajući nož napunjen ledom (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Njemačka) korišten je za rezanje na sagitalne presjeke od 300 do 375 μm. Hladno rasplinjavanje ugljikom (95% O2 i 5% CO2) Niski Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijev fosfatni pufer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoza, 1,0 mM CaCl2 i 6,0 mM MgCl2 Podesite pH na 7,4 i 310 do 330 mOsm). Dobivene moždane rezove prebacite u komoru koja sadrži viši Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijevog fosfatnog pufera, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoze, 4,0 mM CaCl2 i 3,5 mM MgCl2) pH 7,4 i 310 do 320 mOsm. Reze pohranite 20 do 30 minuta kako bi se mogle restaurirati prije snimanja.
snimanje. Za sva snimanja korišten je mikroskopski stolić opremljen fiksnom komorom za snimanje i objektivom za imerziju u vodu s 20x uvećanjem (Scientifica). Pretpostavljene Purkinjeove stanice identificirane su (i) veličinom tijela, (ii) anatomskim položajem malog mozga i (iii) ekspresijom fluorescentnog mtYFP reporterskog gena. Patch pipeta s otporom vrha od 5 do 11 megaoma izvlači se borosilikatnom staklenom kapilarom (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Njemačka) i horizontalnom pipetom Instruments (P-1000, Sutter), Novato, Kalifornija. Sva snimanja provedena su pomoću ELC-03XS npi patch clamp pojačala (npi electronic GmbH, Tam, Njemačka), kojim je upravljao softver Signal (verzija 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Eksperiment je snimljen pri frekvenciji uzorkovanja od 12,5 kHz. Signal se filtrira s dva kratkopropusna Besselova filtera s graničnim frekvencijama od 1,3 i 10 kHz. Kapacitet membrane i pipete kompenzira se kompenzacijskim krugom pomoću pojačala. Svi eksperimenti provedeni su pod kontrolom Orca-Flash 4.0 kamere (Hamamatsu, Gerden, Njemačka), kojom je upravljao Hokawo softver (verzija 2.8, Hamamatsu, Gerden, Njemačka).
Rutinska konfiguracija i analiza cijelih stanica. Neposredno prije snimanja, napunite pipetu unutarnjom otopinom koja sadrži sljedeće tvari: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kalijev glukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM gvanozin trifosfat (GTP) (Na) i 10,0 mM kreatinin fosfat podešeni su na pH 7,25, a osmotski tlak bio je 290 mOsm (saharoza). Odmah nakon primjene sile od 0 pA za probijanje membrane, izmjeren je membranski potencijal mirovanja. Ulazni otpor mjeri se primjenom hiperpolariziranih struja od -40, -30, -20 i -10 pA. Izmjerite magnitudu naponskog odziva i upotrijebite Ohmov zakon za izračun ulaznog otpora. Spontana aktivnost je snimana u naponskim stezaljkama tijekom 5 minuta, a sPSC je identificiran i izmjeren u Igor Pro programu (verzija 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, SAD) korištenjem poluautomatskog skripta za prepoznavanje. IV krivulja i struja u stacionarnom stanju mjere se stezanjem baterije na različitim potencijalima (počevši od -110 mV) i povećanjem napona u koracima od 5 mV. Proizvodnja AP-a testirana je primjenom depolarizirajuće struje. Ćeliju stegnite na -70 mV dok primjenjujete impuls depolarizirajuće struje. Podesite veličinu koraka svake jedinice za snimanje zasebno (10 do 60 pA). Izračunajte maksimalnu AP frekvenciju ručnim brojanjem impulsnih šiljaka koji uzrokuju najvišu AP frekvenciju. AP prag se analizira korištenjem druge derivacije depolarizacijskog impulsa koji prvi pokreće jedan ili više AP-ova.
Konfiguracija i analiza perforiranog flastera. Izvršite snimanje perforiranog flastera koristeći standardne protokole. Koristite pipetu bez ATP-a i GTP-a koja ne sadrži sljedeće sastojke: 128 mM glukonata K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA i 2 mM MgCl2, te podesite pH na 7,2 (pomoću KOH). ATP i GTP su izostavljeni iz unutarstanične otopine kako bi se spriječila nekontrolirana propusnost stanične membrane. Pipeta s flasterom napunjena je unutarnjom otopinom koja sadrži amfotericin (približno 200 do 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) kako bi se dobio zapis perforiranog flastera. Amfotericin je otopljen u dimetil sulfoksidu (konačna koncentracija: 0,1 do 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Koncentracija korištenog DMSO-a nije imala značajan utjecaj na proučavane neurone. Tijekom procesa probijanja, otpor kanala (Ra) je kontinuirano praćen, a eksperiment je započet nakon što se amplituda Ra i AP stabilizirala (20-40 minuta). Spontana aktivnost mjeri se u naponskim i/ili strujnim stezaljkama tijekom 2 do 5 minuta. Analiza podataka provedena je pomoću Igor Pro (verzija 7.05.2, WaveMetrics, SAD), Excel (verzija 2010, Microsoft Corporation, Redmond, SAD) i GraphPad Prism (verzija 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Kako bi se identificirali spontani AP-ovi, koristi se IgorPro-ov NeuroMatic v3.0c dodatak. Automatski identificirajte AP-ove pomoću zadanog praga, koji se individualno podešava za svaki zapis. Korištenjem intervala šiljaka odredite frekvenciju šiljaka s maksimalnom trenutnom frekvencijom šiljaka i prosječnom frekvencijom šiljaka.
Izolacija PN-a. Prilagođavanjem prethodno objavljenom protokolu, PN-ovi su pročišćeni iz mišjeg malog mozga u određenoj fazi (58). Ukratko, mali mozak je seciran i usitnjen u ledeno hladnom mediju za disocijaciju [bez HBSS Ca2+ i Mg2+, nadopunjen s 20 mM glukoze, penicilina (50 U/ml) i streptomicina (0,05 mg/ml)], a zatim je medij razgrađen u papainu [HBSS, nadopunjen s 1-cistein·HCl (1 mg/ml), papainom (16 U/ml) i deoksiribonukleazom I (DNase I; 0,1 mg/ml)]. Tretirajte 30 minuta na 30°C. Prvo isperite tkiva u HBSS mediju koji sadrži sluz jaja (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) i DNazu (0,1 mg/ml) na sobnoj temperaturi kako biste spriječili enzimsku probavu, a zatim u HBSS mediju koji sadrži 20 mM glukoze. Laganim usitnjavanjem u HBSS-u, penicilinu (50 U/ml), streptomicinu (0,05 mg/ml) i DNazi (0,1 mg/ml) oslobađaju se pojedinačne stanice. Dobivena suspenzija stanica filtrirana je kroz cjedilo za stanice od 70 μm, zatim su stanice peletirane centrifugiranjem (1110 rpm, 5 minuta, 4°C) i resuspendirane u mediju za sortiranje [HBSS, nadopunjen s 20 mM glukoze, 20% fetalnog goveđeg seruma, penicilina (50 U/ml) i streptomicina (0,05 mg/ml)]; procijenite održivost stanica propidijevim jodidom i prilagodite gustoću stanica na 1×10⁶ do 2×10⁶ stanica/ml. Prije protočne citometrije, suspenzija je filtrirana kroz cjedilo za stanice od 50 μm.
Protočni citometar. Sortiranje stanica provedeno je na 4°C pomoću FACSAria III stroja (BD Biosciences) i FACSDiva softvera (BD Biosciences, verzija 8.0.1). Stanična suspenzija sortirana je pomoću mlaznice od 100 μm pod tlakom od 20 psi brzinom od ~2800 događaja/sek. Budući da tradicionalni kriteriji usklađivanja (veličina stanica, bimodalna diskriminacija i karakteristike raspršenja) ne mogu osigurati ispravnu izolaciju PN od drugih tipova stanica, strategija usklađivanja postavljena je na temelju izravne usporedbe intenziteta YFP-a i autofluorescencije u mitoYFP+ ​​​​i kontrolnim mitoYFP − miševima. YFP se pobuđuje ozračivanjem uzorka laserskom linijom od 488 nm, a signal se detektira pomoću propusnog filtera od 530/30 nm. U mitoYFP+ ​​​​miševima, relativna snaga reporterskog gena Rosa26-mitoYFP također se koristi za razlikovanje fragmenata neuronskog tijela i aksona. 7-AAD se pobuđuje žutim laserom od 561 nm i detektira propusnim filterom od 675/20 nm kako bi se isključile mrtve stanice. Kako bi se istovremeno odvojili astrociti, suspenzija stanica je obojena s ACSA-2-APC, zatim je uzorak ozračen laserskom linijom od 640 nm, a za detekciju signala korišten je propusni filter od 660/20 nm.
Sakupljene stanice su peletirane centrifugiranjem (1110 okretaja u minuti, 5 minuta, 4 °C) i pohranjene na -80 °C do upotrebe. Mfn2cKO miševi i njihovi mladunci iz legla klasificirani su istog dana kako bi se smanjila varijabilnost postupka. FACS prikaz i analiza podataka provedeni su pomoću FlowJo softvera (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, SAD).
Kao što je gore spomenuto (59), PCR u stvarnom vremenu koristi se za izolaciju DNA iz sortiranih neurona za naknadnu kvantifikaciju mtDNA. Linearnost i prag osjetljivosti u početku su testirani izvođenjem qPCR-a na različitom broju stanica. Ukratko, prikupiti 300 PN u puferu za lizu koji se sastoji od 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 i proteinaze K (200 ng/ml) i inkubirati na 55°C 120 minuta. Stanice su dalje inkubirane na 95°C tijekom 10 minuta kako bi se osigurala potpuna inaktivacija proteinaze K. Korištenjem TaqMan sonde (Thermo Fisher) specifične za mt-Nd1, mtDNA je izmjerena semikvantitativnom PCR-om u 7900HT Real-Time PCR sustavu (Thermo Fisher Scientific). Science, kataloški broj Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, kataloški broj AIVI3E8) i 18S (Thermo Fisher Scientific, kataloški broj Hs99999901_s1) geni.
Priprema uzorka proteoma. Zagrijavanjem otopine na 95°C tijekom 10 minuta i sonikacijom u puferu za lizu [6 M gvanidin klorid, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfin hidroklorid, 10 mM kloroacetamid i 100 mM tris-Lyse smrznutih neuronskih peleta u HCl]. Na Bioruptoru (Diagenode) tijekom 10 minuta (30 sekundi pulsa / 30 sekundi pauze). Uzorak je razrijeđen 1:10 u 20 mM tris-HCl (pH 8,0), pomiješan s 300 ng tripsin zlata (Promega) i inkubiran preko noći na 37°C kako bi se postigla potpuna digestija. Drugog dana uzorak je centrifugiran na 20 000 g tijekom 20 minuta. Supernatant je razrijeđen s 0,1% mravljom kiselinom, a otopina je odsoljena pomoću samostalno izrađenih StageTips vrhova. Uzorak je osušen u SpeedVac instrumentu (Eppendorf koncentrator plus 5305) na 45°C, a zatim je peptid suspendiran u 0,1%-tnoj mravljoj kiselini. Sve uzorke je istovremeno pripremila ista osoba. Kako bi se analizirali uzorci astrocita, 4 μg desaliniziranih peptida obilježeno je tandemskom masom (TMT10plex, kataloški broj 90110, Thermo Fisher Scientific) s omjerom peptida i TMT reagensa od 1:20. Za TMT označavanje, 0,8 mg TMT reagensa resuspendirano je u 70 μl bezvodnog ACN-a, a osušeni peptid rekonstituiran je u 9 μl 0,1 M TEAB-a (trietilamonijev bikarbonat), kojem je dodano 7 μl TMT reagensa u ACN-u. Koncentracija je bila 43,75%. Nakon 60 minuta inkubacije, reakcija je ugašena s 2 μl 5%-tnog hidroksilamina. Označeni peptidi su sakupljeni, osušeni, resuspendirani u 200 μl 0,1%-tne mravlje kiseline (FA), podijeljeni na dva dijela, a zatim odsoljeni pomoću ručno izrađenih StageTips nastavaka. Korištenjem UltiMate 3000 tekućinskog kromatografa ultra visoke učinkovitosti (UltiMate 3000 ultra visokoučinkoviti tekućinski kromatograf), jedna od dvije polovice je frakcionirana na 1 mm x 150 mm Acquity kromatografskoj koloni napunjenoj s 130 Å1,7 μm C18 čestica (Waters, kataloški broj SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Peptide je potrebno odvojiti brzinom protoka od 30 μl/min, odvojiti od 1% do 50% pufera B tijekom 85 minuta s postupnim gradijentom od 96 minuta, od 50% do 95% pufera B tijekom 3 minute, zatim 8 minuta za 95% pufera B; Pufer A je 5% ACN i 10 mM amonijevog bikarbonata (ABC), a pufer B je 80% ACN i 10 mM ABC. Frakcije skupljajte svake 3 minute i kombinirajte ih u dvije skupine (1 + 17, 2 + 18 itd.) te osušite u vakuumskoj centrifugi.
LC-MS/MS analiza. Za masenu spektrometriju, peptidi (broj r119.aq) su odvojeni na analitičkoj koloni PicoFrit od 25 cm, unutarnjeg promjera 75 μm (nova objektivna leća, broj dijela PF7508250) opremljenoj s 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medijem (Dr. Maisch, mat), koristite EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Njemačka). Kolona je održavana na 50°C. Puferi A i B su 0,1% mravlja kiselina u vodi i 0,1% mravlja kiselina u 80% ACN. Peptidi su odvojeni od 6% do 31% pufera B tijekom 65 minuta i od 31% do 50% pufera B tijekom 5 minuta s gradijentom od 200 nl/min. Eluirani peptidi su analizirani na masenom spektrometru Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Mjerenje m/z prekursora peptida provodi se s rezolucijom od 120 000 u rasponu od 350 do 1500 m/z. Korištenjem 27% normalizirane energije sudara, najjači prekursor s nabojnim stanjem od 2 do 6 odabire se za cijepanje disocijacijom C zamkom visoke energije (HCD). Vrijeme ciklusa postavljeno je na 1 s. Vrijednost m/z peptidnog fragmenta izmjerena je u ionskoj zamci korištenjem najmanje AGC mete od 5 × 10⁴ i maksimalnog vremena ubrizgavanja od 86 ms. Nakon fragmentacije, prekursor je stavljen na popis dinamičkog isključenja na 45 s. TMT-obilježeni peptidi su odvojeni na 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap koloni (Thermo Fisher Scientific, kataloški broj 164942), a migracijski spektri su analizirani na Orbitrap Lumos Tribrid masenom spektrometru (Thermo Fisher Scientific) opremljenom opremom za ionske asimetrične valne oblike visokog polja (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) koja radi na dva kompenzacijska napona od -50 i -70 V. MS3 odabran na temelju prekursora sinkronizacije koristi se za mjerenje signala TMT iona. Razdvajanje peptida provedeno je na EASY-nLC 1200, korištenjem 90%-tne linearne gradijentne elucije, s koncentracijom pufera od 6% do 31%; pufer A bio je 0,1% FA, a pufer B bio je 0,1% FA i 80% ACN. Analitička kolona radi na 50°C. Koristite FreeStyle (verzija 1.6, Thermo Fisher Scientific) za dijeljenje izvorne datoteke prema FAIMS kompenzacijskom naponu.
Identifikacija i kvantifikacija proteina. Korištenjem integrirane tražilice Andromeda, izvorni podaci analizirani su pomoću MaxQuant verzije 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Uz sekvence Cre rekombinaze i YFP dobivene iz Aequorea victoria, spektri peptidnih fragmenata pretraženi su za kanonsku sekvencu i izoformnu sekvencu mišjeg referentnog proteoma (Proteome ID UP000000589, preuzet s UniProta u svibnju 2017.). Oksidacija metionina i N-terminalna acetilacija proteina postavljene su kao varijabilne modifikacije; metilacija cistein karbamoila postavljena je kao fiksne modifikacije. Parametri probave postavljeni su na „specifičnost“ i „tripsin/P“. Minimalni broj peptida i razor peptida korištenih za identifikaciju proteina je 1; minimalni broj jedinstvenih peptida je 0. Pod uvjetima podudaranja mape peptida, stopa identifikacije proteina bila je 0,01. Omogućena je opcija „Drugi peptid“. Koristite opciju „podudaranje između prolaza“ za prijenos uspješnih identifikacija između različitih izvornih datoteka. Za kvantifikaciju bez označavanja (LFQ) koristite minimalni omjer LFQ-a broj 1 (60). Intenzitet LFQ-a filtrira se za najmanje dvije valjane vrijednosti u barem jednoj skupini genotipa u svakoj vremenskoj točki i ekstrapolira se iz normalne distribucije širine 0,3 i pomicanja prema dolje 1,8. Za analizu LFQ rezultata koristite Perseus računalnu platformu (https://maxquant.net/perseus/) i R (https://r-project.org/). Za analizu diferencijalne ekspresije korišten je dvosmjerni umjereni t-test iz softverskog paketa limma (61). Istraživačka analiza podataka provedena je pomoću ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally i pheatmap. Podaci proteomike temeljeni na TMT-u analizirani su pomoću MaxQuant verzije 1.6.10.43. Potražite sirove podatke proteomike iz UniProtove baze podataka o ljudskoj proteomici, koja je preuzeta u rujnu 2018. Analiza uključuje faktor korekcije čistoće izotopa koji je dostavio proizvođač. Koristite limma u R-u za analizu diferencijalnih izraza. Izvorni podaci, rezultati pretraživanja baze podataka te tijek rada i rezultati analize podataka pohranjeni su u savezu ProteomeXchange putem partnerskog repozitorija PRIDE s identifikatorom skupa podataka PXD019690.
Funkcionalne anotacije obogaćuju analizu. Alat Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) korišten je za određivanje bogatstva pojmova funkcionalnih anotacija skupa podataka nakon 8 tjedana (Slika 1). Ukratko, kvantitativni popis proteina dobiven analizom podataka LC-MS/MS (tandemska masena spektrometrija) koristi se sa sljedećim kriterijima filtriranja: Mus musculus je odabran kao vrsta i pozadina, a kategorija prikazuje da se P-vrijednost prilagođena Benjaminijem za obogaćivanje 0,05 ili niže smatra značajnom. Za ovaj graf prikazano je pet najvećih suvišnih kategorija u svakom klasteru na temelju prilagođene P-vrijednosti. Korištenjem višestrukog t-testa, korištenjem dvostupanjskog linearnog programa pojačanja Benjaminija, Kriegera i Yekutielija (Q = 5%), analiza ekspresije proteina u vremenu provedena je na važnim kandidatima identificiranim u svakoj kategoriji, a svaki redak analizira se zasebno. Nema potrebe za usvajanjem dosljedne standardne devijacije (SD).
Kako bismo usporedili rezultate ove studije s objavljenim bazama podataka i generirali Vennov dijagram na Slici 1, kombinirali smo kvantitativni popis proteina s MitoCarta 2.0 bilješkama (24). Za generiranje dijagrama upotrijebite online alat Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Za detaljne informacije o statističkim postupcima korištenim za proteomsku analizu, pogledajte odgovarajući odjeljak Materijali i metode. Za sve ostale eksperimente detaljne informacije mogu se pronaći u odgovarajućoj legendi. Osim ako nije drugačije navedeno, svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM, a sve statističke analize provedene su pomoću softvera GraphPad Prism 8.1.2.
Za dodatne materijale za ovaj članak, pogledajte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod uvjetima Creative Commons licence Imenovanje-Nekomercijalno, koja dopušta korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, sve dok konačna upotreba nije u komercijalne svrhe i pretpostavka je da je izvorno djelo ispravno. Referenca.
Napomena: Molimo vas da navedete svoju adresu e-pošte samo kako bi osoba koju preporučite stranici znala da želite da vidi e-poštu i da se ne radi o neželjenoj pošti. Nećemo prikupljati nikakve adrese e-pošte.
Ovo pitanje se koristi za provjeru jeste li posjetitelj i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
Autori: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomska analiza disfunkcionalnih neurona otkrila je da se metabolički programi aktiviraju kako bi se suprotstavili neurodegeneraciji.
Autori: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomska analiza disfunkcionalnih neurona otkrila je da se metabolički programi aktiviraju kako bi se suprotstavili neurodegeneraciji.
©2020 Američka udruga za napredak znanosti. sva prava pridržana. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.