Članak je dio istraživačke teme „Napredne tehnologije bioremedijacije i procesi recikliranja sintetskih organskih spojeva (SOC). Pogledajte svih 14 članaka
Policiklički aromatski ugljikovodici (PAH) niske molekularne težine poput naftalena i supstituiranih naftalena (metilnaftalen, naftojeva kiselina, 1-naftil-N-metilkarbamat itd.) široko se koriste u raznim industrijama te su genotoksični, mutageni i/ili kancerogeni za organizme. Ovi sintetski organski spojevi (SOC) ili ksenobiotici smatraju se prioritetnim onečišćujućim tvarima i predstavljaju ozbiljnu prijetnju globalnom okolišu i javnom zdravlju. Intenzitet ljudskih aktivnosti (npr. uplinjavanje ugljena, rafiniranje nafte, emisije vozila i poljoprivredna primjena) određuje koncentraciju, sudbinu i transport ovih sveprisutnih i postojanih spojeva. Uz fizikalne i kemijske metode obrade/uklanjanja, zelene i ekološki prihvatljive tehnologije poput bioremedijacije, koje koriste mikroorganizme sposobne za potpunu razgradnju POC-ova ili njihovo pretvaranje u netoksične nusproizvode, pojavile su se kao sigurna, isplativa i obećavajuća alternativa. Različite bakterijske vrste koje pripadaju koljenu Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia i Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus i Paenibacillus) i Actinobacteria (Rhodococcus i Arthrobacter) u mikrobioti tla pokazale su sposobnost razgradnje različitih organskih spojeva. Metaboličke studije, genomika i metagenomska analiza pomažu nam da razumijemo kataboličku složenost i raznolikost prisutnu u ovim jednostavnim oblicima života, što se može dalje primijeniti za učinkovitu biorazgradnju. Dugotrajno postojanje PAH-ova rezultiralo je pojavom novih fenotipova razgradnje putem horizontalnog prijenosa gena korištenjem genetskih elemenata kao što su plazmidi, transpozoni, bakteriofagi, genomski otoci i integrativni konjugativni elementi. Sistemska biologija i genetski inženjering specifičnih izolata ili modelnih zajednica (konzorcija) mogu omogućiti sveobuhvatnu, brzu i učinkovitu bioremedijaciju ovih PAH-ova putem sinergističkih učinaka. U ovom pregledu usredotočujemo se na različite metaboličke putove i raznolikost, genetski sastav i raznolikost te stanične odgovore/adaptacije bakterija koje razgrađuju naftalen i supstituirani naftalen. To će pružiti ekološke informacije za terensku primjenu i optimizaciju sojeva za učinkovitu bioremedijaciju.
Brzi razvoj industrija (petrokemija, poljoprivreda, farmaceutski proizvodi, tekstilne boje, kozmetika itd.) pridonio je globalnom gospodarskom prosperitetu i poboljšanju životnog standarda. Taj eksponencijalni razvoj rezultirao je proizvodnjom velikog broja sintetskih organskih spojeva (SOC-ova), koji se koriste za proizvodnju raznih proizvoda. Ovi strani spojevi ili SOC-ovi uključuju policikličke aromatske ugljikovodike (PAH), pesticide, herbicide, plastifikatore, boje, farmaceutske proizvode, organofosfate, usporivače gorenja, hlapljiva organska otapala itd. Ispuštaju se u atmosferu, vodene i kopnene ekosustave gdje imaju višedimenzionalne učinke, uzrokujući štetne učinke na različite bioforme promjenom fizikalno-kemijskih svojstava i strukture zajednice (Petrie i sur., 2015.; Bernhardt i sur., 2017.; Sarkar i sur., 2020.). Mnogi aromatski zagađivači imaju snažan i destruktivan utjecaj na mnoge netaknute ekosustave/vruće točke bioraznolikosti (npr. koraljni grebeni, arktički/antarktički ledeni pokrovi, visokoplaninska jezera, dubokomorski sedimenti itd.) (Jones 2010.; Beyer i sur. 2020.; Nordborg i sur. 2020.). Nedavne geomikrobiološke studije pokazale su da taloženje sintetičkih organskih tvari (npr. aromatskih zagađivača) i njihovih derivata na površinama umjetnih struktura (izgrađenog okoliša) (npr. mjesta kulturne baštine i spomenici od granita, kamena, drva i metala) ubrzava njihovu degradaciju (Gadd 2017.; Liu i sur. 2018.). Ljudske aktivnosti mogu pojačati i pogoršati biološku degradaciju spomenika i zgrada onečišćenjem zraka i klimatskim promjenama (Liu i sur. 2020.). Ovi organski zagađivači reagiraju s vodenom parom u atmosferi i talože se na strukturi, uzrokujući fizičku i kemijsku degradaciju materijala. Biodegradacija je široko prepoznata kao neželjene promjene u izgledu i svojstvima materijala uzrokovane živim organizmima koje utječu na njihovo očuvanje (Pochon i Jaton, 1967.). Daljnje mikrobno djelovanje (metabolizam) ovih spojeva može smanjiti strukturni integritet, učinkovitost očuvanja i kulturnu vrijednost (Gadd, 2017.; Liu i sur., 2018.). S druge strane, u nekim slučajevima utvrđeno je da je mikrobna prilagodba i odgovor na ove strukture koristan jer one formiraju biofilmove i druge zaštitne kore koje smanjuju brzinu propadanja/raspadanja (Martino, 2016.). Stoga, razvoj učinkovitih dugoročnih održivih strategija očuvanja kamenih, metalnih i drvenih spomenika zahtijeva temeljito razumijevanje ključnih procesa uključenih u ovaj proces. U usporedbi s prirodnim procesima (geološki procesi, šumski požari, vulkanske erupcije, biljne i bakterijske reakcije), ljudske aktivnosti rezultiraju ispuštanjem velikih količina policikličkih aromatskih ugljikovodika (PAH) i drugog organskog ugljika (OC) u ekosustave. Mnogi PAH-ovi koji se koriste u poljoprivredi (insekticidi i pesticidi poput DDT-a, atrazina, karbarila, pentaklorofenola itd.), industriji (sirova nafta, naftni talog/otpad, plastika dobivena iz nafte, PCB-i, plastifikatori, deterdženti, dezinficijensi, fumiganti, mirisi i konzervansi), proizvodima za osobnu njegu (kreme za sunčanje, dezinficijensi, repelenti za insekte i policiklički mošusi) i streljivu (eksplozivi poput 2,4,6-TNT-a) potencijalni su ksenobiotici koji mogu utjecati na zdravlje planeta (Srogi, 2007.; Vamsee-Krishna i Phale, 2008.; Petrie i sur., 2015.). Ovaj se popis može proširiti i na spojeve dobivene iz nafte (loživa ulja, maziva, asfaltene), bioplastike visoke molekularne težine i ionske tekućine (Amde i sur., 2015.). Tablica 1 navodi različite aromatske onečišćujuće tvari i njihovu primjenu u raznim industrijama. Posljednjih godina, antropogene emisije hlapljivih organskih spojeva, kao i ugljikovog dioksida i drugih stakleničkih plinova, počele su se povećavati (Dvorak i sur., 2017.). Međutim, antropogeni utjecaji značajno premašuju prirodne. Osim toga, otkrili smo da se brojni organski organski spojevi (SOC) i dalje nalaze u mnogim okolišnim okruženjima te su identificirani kao nove onečišćujuće tvari s negativnim učincima na biome (Slika 1). Agencije za zaštitu okoliša, poput Agencije za zaštitu okoliša Sjedinjenih Država (USEPA), uvrstile su mnoge od ovih onečišćujućih tvari na svoj popis prioriteta zbog njihovih citotoksičnih, genotoksičnih, mutagenih i kancerogenih svojstava. Stoga su potrebni strogi propisi o odlaganju i učinkovite strategije za obradu/uklanjanje otpada iz onečišćenih ekosustava. Različite fizikalne i kemijske metode obrade, poput pirolize, oksidativne termičke obrade, aeracije zraka, odlaganja otpada na odlagališta, spaljivanja itd., neučinkovite su i skupe te stvaraju korozivne, toksične i teško obrađive nusproizvode. S rastućom globalnom ekološkom sviješću, mikroorganizmi sposobni za razgradnju ovih zagađivača i njihovih derivata (poput halogeniranih, nitro, alkilnih i/ili metilnih) privlače sve veću pozornost (Fennell i sur., 2004.; Haritash i Kaushik, 2009.; Phale i sur., 2020.; Sarkar i sur., 2020.; Schwanemann i sur., 2020.). Korištenje ovih autohtonih kandidatskih mikroorganizama samostalno ili u mješovitim kulturama (kolonijama) za uklanjanje aromatskih zagađivača ima prednosti u smislu sigurnosti okoliša, troškova, učinkovitosti, djelotvornosti i održivosti. Istraživači također istražuju integraciju mikrobnih procesa s elektrokemijskim redoks metodama, naime bioelektrokemijskim sustavima (BES), kao obećavajuću tehnologiju za obradu/uklanjanje zagađivača (Huang i sur., 2011.). BES tehnologija privlači sve veću pozornost zbog svoje visoke učinkovitosti, niske cijene, sigurnosti za okoliš, rada na sobnoj temperaturi, biokompatibilnih materijala i mogućnosti oporavka vrijednih nusproizvoda (npr. električne energije, goriva i kemikalija) (Pant i sur., 2012.; Nazari i sur., 2020.). Pojava visokopropusnog sekvenciranja genoma i omics alata/metoda pružila je obilje novih informacija o genetskoj regulaciji, proteomici i fluksomici reakcija različitih mikroorganizama razgraditelja. Kombiniranje ovih alata sa sistemskom biologijom dodatno je poboljšalo naše razumijevanje odabira i finog podešavanja ciljnih kataboličkih puteva u mikroorganizmima (tj. metaboličkog dizajna) kako bi se postigla učinkovita i djelotvorna biodegradacija. Kako bismo osmislili učinkovite strategije bioremedijacije korištenjem prikladnih kandidatskih mikroorganizama, moramo razumjeti biokemijski potencijal, metaboličku raznolikost, genetski sastav i ekologiju (autoekologija/sinekologija) mikroorganizama.
Sl. 1. Izvori i putovi niskomolekularnih PAH-ova kroz različite okolišne uvjete i različite čimbenike koji utječu na biotu. Isprekidane linije predstavljaju interakcije između elemenata ekosustava.
U ovom pregledu pokušali smo sažeti podatke o razgradnji jednostavnih PAH-ova poput naftalena i supstituiranih naftalena različitim bakterijskim izolatima, pokrivajući metaboličke putove i raznolikost, enzime uključene u razgradnju, sastav/sadržaj i raznolikost gena, stanične odgovore i različite aspekte bioremedijacije. Razumijevanje biokemijskih i molekularnih razina pomoći će u identificiranju prikladnih sojeva domaćina i njihovom daljnjem genetskom inženjeringu za učinkovitu bioremedijaciju takvih prioritetnih onečišćujućih tvari. To će pomoći u razvoju strategija za uspostavljanje specifičnih bakterijskih konzorcija za učinkovitu bioremedijaciju.
Prisutnost velikog broja otrovnih i opasnih aromatskih spojeva (koji zadovoljavaju Huckelovo pravilo 4n + 2π elektrona, n = 1, 2, 3, ...) predstavlja ozbiljnu prijetnju raznim okolišnim medijima poput zraka, tla, sedimenata te površinskih i podzemnih voda (Puglisi i sur., 2007.). Ovi spojevi imaju pojedinačne benzenske prstenove (monociklički) ili višestruke benzenske prstenove (policiklički) raspoređene u linearnom, kutnom ili klasterskom obliku i pokazuju stabilnost (stabilnost/nestabilnost) u okolišu zbog visoke negativne rezonantne energije i inertnosti (inertnosti), što se može objasniti njihovom hidrofobnošću i reduciranim stanjem. Kada se aromatski prsten dodatno zamijeni metilnim (-CH3), karboksilnim (-COOH), hidroksilnim (-OH) ili sulfonatnim (-HSO3) skupinama, postaje stabilniji, ima jači afinitet za makromolekule i bioakumulativan je u biološkim sustavima (Seo i sur., 2009.; Phale i sur., 2020.). Neki policiklički aromatski ugljikovodici niske molekularne težine (LMWAH), poput naftalena i njegovih derivata [metilnaftalen, naftojeva kiselina, naftalensulfonat i 1-naftil N-metilkarbamat (karbaril)], uvršteni su na popis prioritetnih organskih onečišćujućih tvari od strane Agencije za zaštitu okoliša SAD-a kao genotoksični, mutageni i/ili kancerogeni (Cerniglia, 1984.). Ispuštanje ove klase NM-PAH-ova u okoliš može rezultirati bioakumulacijom tih spojeva na svim razinama hranidbenog lanca, čime utječe na zdravlje ekosustava (Binkova i sur., 2000.; Srogi, 2007.; Quinn i sur., 2009.).
Izvori i putovi PAH-ova do biote prvenstveno su migracija i interakcije između različitih komponenti ekosustava kao što su tlo, podzemne vode, površinske vode, usjevi i atmosfera (Arey i Atkinson, 2003.). Slika 1 prikazuje interakcije i distribuciju različitih PAH-ova niske molekularne težine u ekosustavima i njihove putove do biote/izloženosti ljudi. PAH-ovi se talože na površinama kao rezultat onečišćenja zraka i migracijom (driftom) emisija vozila, industrijskih ispušnih plinova (uplinjavanje ugljena, izgaranje i proizvodnja koksa) i njihovim taloženjem. Industrijske aktivnosti poput proizvodnje sintetičkih tekstila, boja i premaza; konzervacija drva; prerada gume; aktivnosti proizvodnje cementa; proizvodnja pesticida; i poljoprivredna primjena glavni su izvori PAH-ova u kopnenim i vodenim sustavima (Bamforth i Singleton, 2005.; Wick i sur., 2011.). Studije su pokazale da su tla u prigradskim i urbanim područjima, u blizini autocesta i u velikim gradovima osjetljivija na policikličke aromatske ugljikovodike (PAH) zbog emisija iz elektrana, grijanja stambenih objekata, opterećenja zračnog i cestovnog prometa te građevinskih aktivnosti (Suman i sur., 2016.). (2008.) pokazali su da su PAH-ovi u tlu u blizini cesta u New Orleansu, Louisiana, SAD, bili visoki i do 7189 μg/kg, dok su na otvorenom prostoru iznosili samo 2404 μg/kg. Slično tome, razine PAH-ova i do 300 μg/kg zabilježene su u područjima u blizini mjesta za uplinjavanje ugljena u nekoliko američkih gradova (Kanaly i Harayama, 2000.; Bamforth i Singleton, 2005.). Tla iz raznih indijskih gradova poput Delhija (Sharma i sur., 2008.), Agre (Dubey i sur., 2014.), Mumbaija (Kulkarni i Venkataraman, 2000.) i Visakhapatnama (Kulkarni i sur., 2014.) sadrže visoke koncentracije PAH-ova. Aromatski spojevi se lakše adsorbiraju na čestice tla, organsku tvar i minerale gline, te tako postaju glavni ponori ugljika u ekosustavima (Srogi, 2007.; Peng i sur., 2008.). Glavni izvori PAH-ova u vodenim ekosustavima su oborine (vlažne/suhe oborine i vodena para), gradsko otjecanje, ispuštanje otpadnih voda, obnavljanje podzemnih voda itd. (Srogi, 2007.). Procjenjuje se da oko 80% PAH-ova u morskim ekosustavima potječe od oborina, sedimentacije i ispuštanja otpada (Motelay-Massei i sur., 2006.; Srogi, 2007.). Veće koncentracije PAH-ova u površinskim vodama ili procjednim vodama s odlagališta krutog otpada na kraju prodiru u podzemne vode, što predstavlja veliku prijetnju javnom zdravlju budući da više od 70% stanovništva u južnoj i jugoistočnoj Aziji pije podzemne vode (Duttagupta i sur., 2019.). Nedavna studija Duttagupte i sur. (2020.) o analizama rijeka (32) i podzemnih voda (235) iz Zapadnog Bengala u Indiji otkrila je da se procjenjuje da 53% urbanih stanovnika i 44% ruralnih stanovnika (ukupno 20 milijuna stanovnika) može biti izloženo naftalenu (4,9–10,6 μg/L) i njegovim derivatima. Različiti obrasci korištenja zemljišta i povećana ekstrakcija podzemnih voda smatraju se glavnim čimbenicima koji kontroliraju vertikalni transport (advekciju) PAH-ova niske molekularne težine u podzemlju. Utvrđeno je da su poljoprivredno otjecanje, ispuštanje komunalnih i industrijskih otpadnih voda te ispuštanje krutog otpada/smeća pogođeni PAH-ovima u riječnim slivovima i podzemnim sedimentima. Atmosferske oborine dodatno pogoršavaju onečišćenje PAH-ovima. Visoke koncentracije PAH-ova i njihovih alkilnih derivata (ukupno 51) zabilježene su u rijekama/slivovima diljem svijeta, kao što su rijeke Fraser, Louan, Denso, Missouri, Anacostia, Ebro i Delaware (Yunker i sur., 2002.; Motelay-Massei i sur., 2006.; Li i sur., 2010.; Amoako i sur., 2011.; Kim i sur., 2018.). U sedimentima sliva rijeke Ganges, naftalen i fenantren utvrđeni su kao najznačajniji (otkriveni u 70% uzoraka) (Duttagupta i sur., 2019.). Štoviše, studije su pokazale da kloriranje vode za piće može dovesti do stvaranja toksičnijih oksigeniranih i kloriranih PAH-ova (Manoli i Samara, 1999.). PAH-ovi se nakupljaju u žitaricama, voću i povrću kao rezultat apsorpcije u biljke iz kontaminiranog tla, podzemnih voda i oborina (Fismes i sur., 2002.). Mnogi vodeni organizmi poput ribe, dagnji, školjki i škampa kontaminirani su PAH-ovima konzumacijom kontaminirane hrane i morske vode, kao i putem tkiva i kože (Mackay i Fraser, 2000.). Metode kuhanja/obrade poput roštiljanja, pečenja, dimljenja, prženja, sušenja, pečenja u pećnici i kuhanja na drveni ugljen također mogu dovesti do značajnih količina PAH-ova u hrani. To uvelike ovisi o izboru materijala za dimljenje, sadržaju fenolnih/aromatskih ugljikovodika, postupku kuhanja, vrsti grijača, sadržaju vlage, opskrbi kisikom i temperaturi izgaranja (Guillén i sur., 2000.; Gomes i sur., 2013.). Policiklički aromatski ugljikovodici (PAH) također su otkriveni u mlijeku u različitim koncentracijama (0,75–2,1 mg/L) (Girelli i sur., 2014.). Akumulacija ovih PAH-ova u hrani također ovisi o fizikalno-kemijskim svojstvima hrane, dok su njihovi toksični učinci povezani s fiziološkim funkcijama, metaboličkom aktivnošću, apsorpcijom, distribucijom i distribucijom u tijelu (Mechini i sur., 2011.).
Toksičnost i štetni učinci policikličkih aromatskih ugljikovodika (PAH) poznati su već dugo (Cherniglia, 1984.). Policiklički aromatski ugljikovodici niske molekularne težine (LMW-PAH) (dva do tri prstena) mogu se kovalentno vezati za različite makromolekule poput DNA, RNA i proteina te su kancerogeni (Santarelli i sur., 2008.). Zbog svoje hidrofobne prirode, odvojeni su lipidnim membranama. Kod ljudi, citokrom P450 monooksigenaze oksidiraju PAH u epokside, od kojih su neki vrlo reaktivni (npr. baediol epoksid) i mogu dovesti do transformacije normalnih stanica u maligne (Marston i sur., 2001.). Osim toga, produkti transformacije PAH-ova poput kinona, fenola, epoksida, diola itd. toksičniji su od matičnih spojeva. Neki PAH-ovi i njihovi metabolički međuprodukti mogu utjecati na hormone i različite enzime u metabolizmu, čime negativno utječu na rast, središnji živčani sustav, reproduktivni i imunološki sustav (Swetha i Phale, 2005.; Vamsee-Krishna i sur., 2006.; Oostingh i sur., 2008.). Prijavljeno je da kratkotrajna izloženost PAH-ovima niske molekularne težine uzrokuje oštećenu funkciju pluća i trombozu kod astmatičara te povećava rizik od raka kože, pluća, mjehura i gastrointestinalnog trakta (Olsson i sur., 2010.; Diggs i sur., 2011.). Studije na životinjama također su pokazale da izloženost PAH-ovima može imati štetne učinke na reproduktivnu funkciju i razvoj te može uzrokovati kataraktu, oštećenje bubrega i jetre te žuticu. Pokazalo se da razni produkti biotransformacije PAH-ova, poput diola, epoksida, kinona i slobodnih radikala (kationa), tvore DNA adukte. Pokazalo se da stabilni adukti mijenjaju mehanizam replikacije DNK, dok nestabilni adukti mogu depurinirati DNK (uglavnom do adenina, a ponekad i do gvanina); oba mogu generirati pogreške koje dovode do mutacija (Schweigert i sur. 2001.). Osim toga, kinoni (benzo-/pan-) mogu generirati reaktivne vrste kisika (ROS), uzrokujući fatalna oštećenja DNK i drugih makromolekula, čime utječu na funkciju/vijabilnost tkiva (Ewa i Danuta 2017.). Prijavljeno je da kronična izloženost niskim koncentracijama pirena, bifenila i naftalena uzrokuje rak kod pokusnih životinja (Diggs i sur. 2012.). Zbog njihove smrtonosne toksičnosti, čišćenje/uklanjanje ovih PAH-ova s ​​pogođenih/kontaminiranih mjesta je prioritet.
Različite fizikalne i kemijske metode korištene su za uklanjanje PAH-ova s ​​kontaminiranih mjesta/okoliša. Procesi poput spaljivanja, dekloriranja, UV oksidacije, fiksacije i ekstrakcije otapalima imaju mnoge nedostatke, uključujući stvaranje toksičnih nusprodukata, složenost procesa, sigurnosne i regulatorne probleme, nisku učinkovitost te visoke troškove. Međutim, mikrobna biodegradacija (nazvana bioremedijacija) obećavajući je alternativni pristup koji uključuje korištenje mikroorganizama u obliku čistih kultura ili kolonija. U usporedbi s fizikalnim i kemijskim metodama, ovaj proces je ekološki prihvatljiv, neinvazivan, isplativ i održiv. Bioremedijacija se može provoditi na zahvaćenom mjestu (in situ) ili na posebno pripremljenom mjestu (ex situ) te se stoga smatra održivijom metodom sanacije od tradicionalnih fizikalnih i kemijskih metoda (Juhasz i Naidu, 2000.; Andreoni i Gianfreda, 2007.; Megharaj i sur., 2011.; Phale i sur., 2020.; Sarkar i sur., 2020.).
Razumijevanje mikrobnih metaboličkih koraka uključenih u razgradnju aromatskih onečišćujućih tvari ima ogromne znanstvene i ekonomske implikacije za ekološku i okolišnu održivost. Procjenjuje se da se 2,1 × 10^18 grama ugljika (C) pohranjuje u sedimentima i organskim spojevima (tj. nafti, prirodnom plinu i ugljenu, tj. fosilnim gorivima) diljem svijeta, što značajno doprinosi globalnom ciklusu ugljika. Međutim, brza industrijalizacija, ekstrakcija fosilnih goriva i ljudske aktivnosti iscrpljuju ove litosferske rezervoare ugljika, ispuštajući procijenjenih 5,5 × 10^15 g organskog ugljika (kao onečišćujućih tvari) u atmosferu godišnje (Gonzalez-Gaya i sur., 2019.). Većina ovog organskog ugljika ulazi u kopnene i morske ekosustave sedimentacijom, transportom i otjecanjem. Osim toga, novi sintetski onečišćujući tvari dobiveni iz fosilnih goriva, poput plastike, plastifikatora i stabilizatora plastike (ftalati i njihovi izomeri), ozbiljno onečišćuju morske, tla i vodene ekosustave te njihov biotski svijet, čime se pogoršavaju globalne klimatske rizike. Različite vrste mikroplastike, nanoplastike, plastičnih fragmenata i njihovih toksičnih monomernih produkata dobivenih iz polietilen tereftalata (PET) nakupile su se u Tihom oceanu između Sjeverne Amerike i jugoistočne Azije, tvoreći „Veliku pacifičku krpu smeća“ i šteteći morskom životu (Newell i sur., 2020.). Znanstvene studije su dokazale da nije moguće ukloniti takve zagađivače/otpad nikakvim fizičkim ili kemijskim metodama. U tom kontekstu, najkorisniji mikroorganizmi su oni koji su sposobni oksidativno metabolizirati zagađivače u ugljikov dioksid, kemijsku energiju i druge netoksične nusproizvode koji na kraju ulaze u druge procese kruženja hranjivih tvari (H, O, N, S, P, Fe itd.). Stoga je razumijevanje mikrobne ekofiziologije mineralizacije aromatskih zagađivača i njezine kontrole okoliša ključno za procjenu mikrobnog ciklusa ugljika, neto ugljičnog proračuna i budućih klimatskih rizika. S obzirom na hitnu potrebu za uklanjanjem takvih spojeva iz okoliša, pojavile su se različite eko-industrije usmjerene na čiste tehnologije. Alternativno, valorizacija industrijskog otpada/otpadnih kemikalija akumuliranih u ekosustavima (tj. pristup "od otpada do bogatstva") smatra se jednim od stupova kružnog gospodarstva i ciljeva održivog razvoja (Close i sur., 2012.). Stoga je razumijevanje metaboličkih, enzimskih i genetskih aspekata ovih potencijalnih kandidata za razgradnju od najveće važnosti za učinkovito uklanjanje i bioremedijaciju takvih aromatskih zagađivača.
Među mnogim aromatskim zagađivačima, posebnu pozornost posvećujemo PAH-ovima niske molekularne težine poput naftalena i supstituiranih naftalena. Ovi spojevi glavne su komponente goriva dobivenih iz nafte, tekstilnih boja, potrošačkih proizvoda, pesticida (naftalina i repelenta protiv insekata), plastifikatora i tanina te su stoga široko rasprostranjeni u mnogim ekosustavima (Preuss i sur., 2003.). Nedavna izvješća ističu akumulaciju koncentracija naftalena u sedimentima vodonosnika, podzemnim vodama i podzemnim tlima, vadoznim zonama i riječnim koritima, što sugerira njegovu bioakumulaciju u okolišu (Duttagupta i sur., 2019., 2020.). Tablica 2 sažima fizikalno-kemijska svojstva, primjenu i zdravstvene učinke naftalena i njegovih derivata. U usporedbi s drugim PAH-ovima visoke molekularne težine, naftalen i njegovi derivati ​​manje su hidrofobni, topljiviji u vodi i široko rasprostranjeni u ekosustavima, pa se često koriste kao modelni supstrati za proučavanje metabolizma, genetike i metaboličke raznolikosti PAH-ova. Velik broj mikroorganizama sposoban je metabolizirati naftalen i njegove derivate, a dostupne su sveobuhvatne informacije o njihovim metaboličkim putovima, enzimima i regulatornim značajkama (Mallick i sur., 2011.; Phale i sur., 2019., 2020.). Osim toga, naftalen i njegovi derivati ​​označeni su kao prototipni spojevi za procjenu onečišćenja okoliša zbog svoje velike zastupljenosti i bioraspoloživosti. Američka agencija za zaštitu okoliša procjenjuje da su prosječne razine naftalena 5,19 μg po kubnom metru iz dima cigareta, prvenstveno iz nepotpunog izgaranja, i 7,8 do 46 μg iz sporednog dima, dok je izloženost kreozotu i naftalanu 100 do 10 000 puta veća (Preuss i sur. 2003.). Posebno je utvrđeno da naftalen ima respiratornu toksičnost i karcinogenost specifičnu za vrstu, regiju i spol. Na temelju studija na životinjama, Međunarodna agencija za istraživanje raka (IARC) klasificirala je naftalen kao „mogući ljudski karcinogen“ (Skupina 2B)1. Izloženost supstituiranim naftalenima, prvenstveno inhalacijom ili parenteralnom (oralnom) primjenom, uzrokuje oštećenje plućnog tkiva i povećava učestalost tumora pluća kod štakora i miševa (Nacionalni toksikološki program 2). Akutni učinci uključuju mučninu, povraćanje, bol u trbuhu, proljev, glavobolju, zbunjenost, obilno znojenje, vrućicu, tahikardiju itd. S druge strane, zabilježeno je da je insekticid širokog spektra na bazi karbamata karbaril (1-naftil N-metilkarbamat) toksičan za vodene beskralježnjake, vodozemce, medonosne pčele i ljude te da inhibira acetilkolinesterazu uzrokujući paralizu (Smulders i sur., 2003.; Bulen i Distel, 2011.). Stoga je razumijevanje mehanizama mikrobne razgradnje, genetske regulacije, enzimskih i staničnih reakcija ključno za razvoj strategija bioremedijacije u kontaminiranim okolišima.
Tablica 2. Detaljne informacije o fizikalno-kemijskim svojstvima, upotrebi, metodama identifikacije i povezanim bolestima naftalena i njegovih derivata.
U onečišćenim nišama, hidrofobni i lipofilni aromatski zagađivači mogu uzrokovati razne stanične učinke na okolišni mikrobiom (zajednicu), kao što su promjene u fluidnosti membrane, propusnosti membrane, bubrenje lipidnog dvosloja, poremećaj prijenosa energije (lanac prijenosa elektrona/pokretačka sila protona) i aktivnost proteina povezanih s membranom (Sikkema i sur., 1995.). Osim toga, neki topljivi međuprodukti poput katehola i kinona stvaraju reaktivne vrste kisika (ROS) i tvore adukte s DNA i proteinima (Penning i sur., 1999.). Dakle, obilje takvih spojeva u ekosustavima vrši selektivni pritisak na mikrobne zajednice da postanu učinkoviti razgraditelji na različitim fiziološkim razinama, uključujući unos/transport, unutarstančnu transformaciju, asimilaciju/iskorištavanje i kompartmentalizaciju.
Pretraživanje Ribosomal Database Project-II (RDP-II) otkrilo je da je iz medija ili kultura obogaćenja kontaminiranih naftalenom ili njegovim derivatima izolirano ukupno 926 bakterijskih vrsta. Skupina Proteobacteria imala je najveći broj predstavnika (n = 755), a slijede Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) i neklasificirane bakterije (8) (Slika 2). Predstavnici γ-Proteobacteria (Pseudomonadales i Xanthomonadales) dominirali su svim gram-negativnim skupinama s visokim udjelom G+C (54%), dok su Clostridiales i Bacillales (30%) bili gram-pozitivne skupine s niskim udjelom G+C. Zabilježeno je da Pseudomonas (najveći broj, 338 vrsta) mogu razgraditi naftalen i njegove metilne derivate u raznim onečišćenim ekosustavima (katran ugljena, nafta, sirova nafta, mulj, izlijevanje nafte, otpadne vode, organski otpad i odlagališta otpada), kao i u netaknutim ekosustavima (tlo, rijeke, sedimenti i podzemne vode) (Slika 2). Štoviše, studije obogaćivanja i metagenomska analiza nekih od ovih regija otkrile su da nekultivirane vrste Legionella i Clostridium mogu imati razgradni kapacitet, što ukazuje na potrebu za uzgojem ovih bakterija kako bi se proučili novi putovi i metabolička raznolikost.
Sl. 2. Taksonomska raznolikost i ekološka distribucija bakterijskih predstavnika u okolišima kontaminiranim naftalenom i derivatima naftalena.
Među raznim mikroorganizmima koji razgrađuju aromatske ugljikovodike, većina je sposobna razgraditi naftalen kao jedini izvor ugljika i energije. Slijed događaja uključenih u metabolizam naftalena opisan je za Pseudomonas sp. (sojevi: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 i CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 i drugi sojevi (ND6 i AS1) (Mahajan i sur., 1994.; Resnick i sur., 1996.; Annweiler i sur., 2000.; Basu i sur., 2003.; Dennis i Zylstra, 2004.; Sota i sur., 2006.; Metabolizam pokreće višekomponentna dioksigenaza [naftalen dioksigenaza (NDO), dioksigenaza koja hidroksilira prsten] koja katalizira oksidaciju jednog od aromatskih prstenova naftalena koristeći molekularni kisik kao drugi supstrat, pretvarajući naftalen u cis-naftalendiol (Slika 3). Cis-dihidrodiol se pretvara u 1,2-dihidroksinaftalen pomoću dehidrogenaze. Enzim koji cijepa prsten dioksigenaza, 1,2-dihidroksinaftalen dioksigenaza (12DHNDO), pretvara 1,2-dihidroksinaftalen u 2-hidroksikromen-2-karboksilnu kiselinu. Enzimska cis-trans izomerizacija proizvodi trans-o-hidroksibenzilidenpiruvat, koji se cijepa hidratazom aldolazom na salicilni aldehid i piruvat. Organska kiselina piruvat bio je prvi C3 spoj izveden iz naftalenskog ugljikovog skeleta i usmjeren u središnji ugljikov put. Osim toga, NAD+-ovisna salicilaldehid dehidrogenaza pretvara salicilaldehid u salicilnu kiselinu. Metabolizam u ovoj fazi naziva se "gornji put" razgradnje naftalena. Ovaj put je vrlo čest kod većine bakterija koje razgrađuju naftalen. Međutim, postoji nekoliko iznimaka; na primjer, kod termofilnog Bacillus hamburgii 2, razgradnju naftalena pokreće naftalen 2,3-dioksigenaza dajući 2,3-dihidroksinaftalen (Annweiler i sur., 2000.).
Slika 3. Putovi razgradnje naftalena, metilnaftalena, naftojeve kiseline i karbarila. Zaokruženi brojevi predstavljaju enzime odgovorne za sekvencijalnu pretvorbu naftalena i njegovih derivata u naknadne produkte. 1 — naftalen dioksigenaza (NDO); 2, cis-dihidrodiol dehidrogenaza; 3, 1,2-dihidroksinaftalen dioksigenaza; 4, izomeraza 2-hidroksikromen-2-karboksilne kiseline; 5, trans-O-hidroksibenzilidenpiruvat hidrataza aldolaza; 6, salicilaldehid dehidrogenaza; 7, salicilat 1-hidroksilaza; 8, katehol 2,3-dioksigenaza (C23DO); 9, 2-hidroksimukonat semialdehid dehidrogenaza; 10, 2-oksopent-4-enoat hidrataza; 11, 4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolaza; 12, acetaldehid dehidrogenaza; 13, katehol-1,2-dioksigenaza (C12DO); 14, mukonat cikloizomeraza; 15, mukonolakton delta-izomeraza; 16, β-ketoadipatenolakton hidrolaza; 17, β-ketoadipat sukcinil-CoA transferaza; 18, β-ketoadipat-CoA tiolaza; 19, sukcinil-CoA: acetil-CoA sukciniltransferaza; 20, salicilat 5-hidroksilaza; 21 – gentizat 1,2-dioksigenaza (GDO); 22, maleilpiruvat izomeraza; 23, fumarilpiruvat hidrolaza; 24, metilnaftalen hidroksilaza (NDO); 25, hidroksimetilnaftalen dehidrogenaza; 26, naftaldehid dehidrogenaza; 27, 3-formilsalicilna kiselina oksidaza; 28, hidroksiizoftalat dekarboksilaza; 29, karbaril hidrolaza (CH); 30, 1-naftol-2-hidroksilaza.
Ovisno o organizmu i njegovom genetskom sastavu, rezultirajuća salicilna kiselina se dalje metabolizira ili putem kateholnog puta pomoću salicilat 1-hidroksilaze (S1H) ili putem gentizatnog puta pomoću salicilat 5-hidroksilaze (S5H) (Slika 3). Budući da je salicilna kiselina glavni međuprodukt u metabolizmu naftalena (gornji put), koraci od salicilne kiseline do TCA međuprodukta često se nazivaju donjim putem, a geni su organizirani u jedan operon. Uobičajeno je vidjeti da su geni u operonu gornjeg puta (nah) i operonu donjeg puta (sal) regulirani zajedničkim regulatornim čimbenicima; na primjer, NahR i salicilna kiselina djeluju kao induktori, omogućujući oba operona da potpuno metaboliziraju naftalen (Phale i sur., 2019., 2020.).
Osim toga, katehol se ciklički cijepa na 2-hidroksimukonat semialdehid putem meta puta pomoću katehol 2,3-dioksigenaze (C23DO) (Yen i sur., 1988.) i dalje hidrolizira pomoću 2-hidroksimukonat semialdehid hidrolaze dajući 2-hidroksipent-2,4-diensku kiselinu. 2-hidroksipent-2,4-dienoat se zatim pretvara u piruvat i acetaldehid pomoću hidrataze (2-oksopent-4-enoat hidrataza) i aldolaze (4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolaza), a zatim ulazi u središnji ugljikov put (Slika 3). Alternativno, katehol se ciklički cijepa na cis,cis-mukonat putem orto puta pomoću katehol 1,2-oksigenaze (C12DO). Mukonat cikloizomeraza, mukonolakton izomeraza i β-ketoadipat-nolakton hidrolaza pretvaraju cis,cis-mukonat u 3-oksoadipat, koji ulazi u središnji ugljikov put putem sukcinil-CoA i acetil-CoA (Nozaki i sur., 1968.) (Slika 3).
U gentizatnom (2,5-dihidroksibenzoatnom) putu, aromatski prsten se cijepa pomoću gentizat 1,2-dioksigenaze (GDO) i tvori maleilpiruvat. Ovaj produkt može se izravno hidrolizirati u piruvat i malat ili se može izomerizirati u fumarilpiruvat, koji se zatim može hidrolizirati u piruvat i fumarat (Larkin i Day, 1986.). Izbor alternativnog puta uočen je i kod gram-negativnih i kod gram-pozitivnih bakterija na biokemijskoj i genetskoj razini (Morawski i sur., 1997.; Whyte i sur., 1997.). Gram-negativne bakterije (Pseudomonas) preferiraju korištenje salicilne kiseline, koja je induktor metabolizma naftalena, dekarboksilirajući je u katehol pomoću salicilat 1-hidroksilaze (Gibson i Subramanian, 1984.). S druge strane, kod gram-pozitivnih bakterija (Rhodococcus), salicilat 5-hidroksilaza pretvara salicilnu kiselinu u gentizinsku kiselinu, dok salicilna kiselina nema induktivni učinak na transkripciju naftalenskih gena (Grund i sur., 1992.) (Slika 3).
Izviješteno je da vrste poput Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas i Mycobacterium mogu razgraditi monometilnaftalen ili dimetilnaftalen (Dean-Raymond i Bartha, 1975.; Cane i Williams, 1982.; Mahajan i sur., 1994.; Dutta i sur., 1998.; Hedlund i sur., 1999.). Među njima, put razgradnje 1-metilnaftalena i 2-metilnaftalena Pseudomonas sp. CSV86 jasno je proučen na biokemijskoj i enzimskoj razini (Mahajan i sur., 1994.). 1-metilnaftalen se metabolizira putem dva puta. Prvo, aromatski prsten se hidroksilira (nesupstituirani prsten metilnaftalena) kako bi se formirao cis-1,2-dihidroksi-1,2-dihidro-8-metilnaftalen, koji se dalje oksidira u metil salicilat i metilkatehol, a zatim ulazi u središnji ugljikov put nakon cijepanja prstena (Slika 3). Ovaj put se naziva „put izvora ugljika“. U drugom „putu detoksikacije“, metilna skupina može se hidroksilirati pomoću NDO-a kako bi se formirao 1-hidroksimetilnaftalen, koji se dalje oksidira u 1-naftojevu kiselinu i izlučuje u medij za uzgoj kao produkt bez ostataka. Studije su pokazale da soj CSV86 ne može rasti na 1- i 2-naftojevoj kiselini kao jedinom izvoru ugljika i energije, što potvrđuje njegov put detoksikacije (Mahajan i sur., 1994.; Basu i sur., 2003.). U 2-metilnaftalenu, metilna skupina podliježe hidroksilaciji hidroksilazom kako bi se formirao 2-hidroksimetilnaftalen. Osim toga, nesupstituirani prsten naftalenskog prstena podliježe hidroksilaciji prstena kako bi se formirao dihidrodiol, koji se oksidira u 4-hidroksimetilkatehol u nizu enzimski kataliziranih reakcija i ulazi u središnji ugljikov put putem puta cijepanja meta-prstena. Slično tome, za S. paucimobilis 2322 je objavljeno da koristi NDO za hidroksilaciju 2-metilnaftalena, koji se dalje oksidira u metil salicilat i metilkatehol (Dutta i sur., 1998.).
Naftojeve kiseline (supstituirane/nesupstituirane) su nusprodukti detoksikacije/biotransformacije koji nastaju tijekom razgradnje metilnaftalena, fenantrena i antracena i oslobađaju se u iskorišteni medij za uzgoj. Izviješteno je da izolat iz tla Stenotrophomonas maltophilia CSV89 može metabolizirati 1-naftojevu kiselinu kao izvor ugljika (Phale i sur., 1995.). Metabolizam započinje dihidroksilacijom aromatskog prstena kako bi se formirao 1,2-dihidroksi-8-karboksinaftalen. Rezultirajući diol se oksidira u katehol putem 2-hidroksi-3-karboksibenzilidenpiruvata, 3-formilsalicilne kiseline, 2-hidroksiizoftalne kiseline i salicilne kiseline te ulazi u središnji ugljikov put putem puta cijepanja meta-prstena (Slika 3).
Karbaril je pesticid naftil karbamata. Od Zelene revolucije u Indiji 1970-ih, upotreba kemijskih gnojiva i pesticida dovela je do povećanja emisija policikličkih aromatskih ugljikovodika (PAH) iz poljoprivrednih raspršenih izvora (Pingali, 2012.; Duttagupta i sur., 2020.). Procjenjuje se da se 55% (85.722.000 hektara) ukupnog obradivog zemljišta u Indiji tretira kemijskim pesticidima. Tijekom posljednjih pet godina (2015. – 2020.) indijski poljoprivredni sektor godišnje je koristio u prosjeku 55.000 do 60.000 tona pesticida (Odjel za zadruge i dobrobit poljoprivrednika, Ministarstvo poljoprivrede, Vlada Indije, kolovoz 2020.). U sjevernim i središnjim gangeskim ravnicama (države s najvećom populacijom i gustoćom naseljenosti), upotreba pesticida na usjevima je raširena, a prevladavaju insekticidi. Karbaril (1-naftil-N-metilkarbamat) je karbamatni insekticid širokog spektra djelovanja, umjereno do vrlo toksičan, koji se koristi u indijskoj poljoprivredi u prosječnoj količini od 100-110 tona. Obično se prodaje pod trgovačkim nazivom Sevin i koristi se za suzbijanje insekata (lisnih uši, vatrenih mrava, buha, grinja, pauka i mnogih drugih vanjskih štetnika) koji utječu na razne usjeve (kukuruz, soju, pamuk, voće i povrće). Neki mikroorganizmi poput Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus i Arthrobacter također se mogu koristiti za suzbijanje drugih štetnika. Izviješteno je da RC100 može razgraditi karbaril (Larkin i Day, 1986.; Chapalamadugu i Chaudhry, 1991.; Hayatsu i sur., 1999.; Swetha i Phale, 2005.; Trivedi i sur., 2017.). Put razgradnje karbarila opsežno je proučavan na biokemijskoj, enzimskoj i genetskoj razini u izolatima tla Pseudomonas sp. Sojevi C4, C5 i C6 (Swetha i Phale, 2005.; Trivedi i sur., 2016.) (slika 3). Metabolički put započinje hidrolizom esterske veze karbaril hidrolazom (CH) kako bi se formirao 1-naftol, metilamin i ugljikov dioksid. 1-naftol se zatim pretvara u 1,2-dihidroksinaftalen pomoću 1-naftol hidroksilaze (1-NH), koji se dalje metabolizira središnjim ugljikovim putem putem salicilata i gentizata. Zabilježeno je da neke bakterije koje razgrađuju karbaril metaboliziraju naftalen u salicilnu kiselinu cijepanjem kateholnog orto prstena (Larkin i Day, 1986.; Chapalamadugu i Chaudhry, 1991.). Važno je napomenuti da bakterije koje razgrađuju naftalen prvenstveno metaboliziraju salicilnu kiselinu putem katehola, dok bakterije koje razgrađuju karbaril preferiraju metabolizirati salicilnu kiselinu putem gentizatnog puta.
Derivati ​​naftalensulfonske kiseline/disulfonske kiseline i naftilaminsulfonske kiseline mogu se koristiti kao međuprodukti u proizvodnji azo bojila, sredstava za kvašenje, disperzanata itd. Iako ovi spojevi imaju nisku toksičnost za ljude, procjene citotoksičnosti pokazale su da su smrtonosni za ribe, dafnije i alge (Greim i sur., 1994.). Za predstavnike roda Pseudomonas (sojevi A3, C22) zabilježeno je da pokreću metabolizam dvostrukom hidroksilacijom aromatskog prstena koji sadrži skupinu sulfonske kiseline kako bi nastao dihidrodiol, koji se dalje pretvara u 1,2-dihidroksinaftalen spontanim cijepanjem sulfitne skupine (Brilon i sur., 1981.). Rezultirajući 1,2-dihidroksinaftalen katabolizira se klasičnim naftalenskim putem, tj. kateholnim ili gentizatnim putem (Slika 4). Pokazano je da se aminonaftalensulfonska kiselina i hidroksinaftalensulfonska kiselina mogu potpuno razgraditi miješanim bakterijskim konzorcijima s komplementarnim kataboličkim putovima (Nortemann i sur., 1986.). Pokazano je da jedan član konzorcija desumporizira aminonaftalensulfonsku kiselinu ili hidroksinaftalensulfonsku kiselinu 1,2-dioksigenacijom, dok se aminosalicilat ili hidroksisalicilat oslobađa u medij za uzgoj kao metabolit koji se potom apsorbira od strane drugih članova konzorcija. Naftalendisulfonska kiselina je relativno polarna, ali slabo biorazgradiva i stoga se može metabolizirati različitim putovima. Prva desumporizacija događa se tijekom regioselektivne dihidroksilacije aromatskog prstena i skupine sulfonske kiseline; druga desumporizacija događa se tijekom hidroksilacije 5-sulfosalicilne kiseline pomoću salicilne kiseline 5-hidroksilaze, čime nastaje gentizinska kiselina, koja ulazi u središnji ugljikov put (Brilon i sur., 1981.) (Slika 4). Enzimi odgovorni za razgradnju naftalena također su odgovorni za metabolizam naftalen sulfonata (Brilon i sur., 1981.; Keck i sur., 2006.).
Slika 4. Metabolički putevi za razgradnju naftalen sulfonata. Brojevi unutar krugova predstavljaju enzime odgovorne za metabolizam naftil sulfonata, slične/identične enzimima opisanim na SLICI 3.
Niskomolekularni PAH-ovi (LMW-PAH) su reducibilni, hidrofobni i slabo topljivi te stoga nisu podložni prirodnoj razgradnji/degradaciji. Međutim, aerobni mikroorganizmi mogu ih oksidirati apsorpcijom molekularnog kisika (O2). Ovi enzimi uglavnom pripadaju klasi oksidoreduktaza i mogu izvoditi različite reakcije poput hidroksilacije aromatskog prstena (mono- ili dihidroksilacija), dehidrogenacije i cijepanja aromatskog prstena. Produkti dobiveni ovim reakcijama su u višem oksidacijskom stanju i lakše se metaboliziraju putem središnjeg ugljikovog puta (Phale i sur., 2020.). Izviješteno je da su enzimi u putu razgradnje inducibilni. Aktivnost ovih enzima je vrlo niska ili zanemariva kada se stanice uzgajaju na jednostavnim izvorima ugljika poput glukoze ili organskih kiselina. Tablica 3 sažima različite enzime (oksigenaze, hidrolaze, dehidrogenaze, oksidaze itd.) uključene u metabolizam naftalena i njegovih derivata.
Tablica 3. Biokemijske karakteristike enzima odgovornih za razgradnju naftalena i njegovih derivata.
Radioizotopske studije (18O2) pokazale su da je ugradnja molekularnog O2 u aromatske prstenove pomoću oksigenaza najvažniji korak u aktiviranju daljnje biodegradacije spoja (Hayaishi i sur., 1955.; Mason i sur., 1955.). Ugradnja jednog atoma kisika (O) iz molekularnog kisika (O2) u supstrat započinje se endogenim ili egzogenim monooksigenazama (također nazvanim hidroksilazama). Drugi atom kisika reducira se u vodu. Egzogene monooksigenaze reduciraju flavin s NADH ili NADPH, dok se u endomonooksigenazama flavin reducira supstratom. Položaj hidroksilacije rezultira raznolikošću u stvaranju produkta. Na primjer, salicilat 1-hidroksilaza hidroksilira salicilnu kiselinu na položaju C1, tvoreći katehol. S druge strane, višekomponentna salicilat 5-hidroksilaza (koja sadrži podjedinice reduktaze, feredoksina i oksigenaze) hidroksilira salicilnu kiselinu na položaju C5, tvoreći gentizinsku kiselinu (Yamamoto i sur., 1965.).
Dioksigenaze ugrađuju dva atoma O2 u supstrat. Ovisno o nastalim produktima, dijele se na dioksigenaze koje hidroksiliraju prsten i dioksigenaze koje cijepaju prsten. Dioksigenaze koje hidroksiliraju prsten pretvaraju aromatske supstrate u cis-dihidrodiole (npr. naftalen) i široko su rasprostranjene među bakterijama. Do danas je pokazano da organizmi koji sadrže dioksigenaze koje hidroksiliraju prsten sposobni su rasti na različitim aromatskim izvorima ugljika, a ti su enzimi klasificirani kao NDO (naftalen), toluen dioksigenaza (TDO, toluen) i bifenil dioksigenaza (BPDO, bifenil). I NDO i BPDO mogu katalizirati dvostruku oksidaciju i hidroksilaciju bočnog lanca različitih policikličkih aromatskih ugljikovodika (toluen, nitrotoluen, ksilen, etilbenzen, naftalen, bifenil, fluoren, indol, metilnaftalen, naftalensulfonat, fenantren, antracen, acetofenon itd.) (Boyd i Sheldrake, 1998.; Phale i sur., 2020.). NDO je višekomponentni sustav koji se sastoji od oksidoreduktaze, feredoksina i komponente oksigenaze koja sadrži aktivno mjesto (Gibson i Subramanian, 1984.; Resnick i sur., 1996.). Katalitička jedinica NDO-a sastoji se od velike α podjedinice i male β podjedinice raspoređenih u α3β3 konfiguraciji. NDO pripada velikoj obitelji oksigenaza, a njegova α-podjedinica sadrži Rieskeovo mjesto [2Fe-2S] i mononuklearni nehemski željezo, koji određuje specifičnost supstrata NDO-a (Parales i sur., 1998.). Tipično, u jednom katalitičkom ciklusu, dva elektrona iz redukcije piridin nukleotida prenose se na Fe(II) ion u aktivnom mjestu putem reduktaze, feredoksina i Rieskeovog mjesta. Redukcijski ekvivalenti aktiviraju molekularni kisik, što je preduvjet za dihidroksilaciju supstrata (Ferraro i sur., 2005.). Do danas je samo nekoliko NDO-a pročišćeno i detaljno karakterizirano iz različitih sojeva, a genetska kontrola putova uključenih u razgradnju naftalena detaljno je proučena (Resnick i sur., 1996.; Parales i sur., 1998.; Karlsson i sur., 2003.). Dioksigenaze koje cijepaju prsten (enzimi koji cijepaju endo- ili orto-prsten i enzimi koji cijepaju egzodiol- ili meta-prsten) djeluju na hidroksilirane aromatske spojeve. Na primjer, dioksigenaza koja cijepa orto-prsten je katehol-1,2-dioksigenaza, dok je dioksigenaza koja cijepa meta-prsten katehol-2,3-dioksigenaza (Kojima i sur., 1961.; Nozaki i sur., 1968.). Osim raznih oksigenaza, postoje i razne dehidrogenaze odgovorne za dehidrogenaciju aromatskih dihidrodiola, alkohola i aldehida, a koriste NAD+/NADP+ kao akceptore elektrona, koji su neki od važnih enzima uključenih u metabolizam (Gibson i Subramanian, 1984.; Shaw i Harayama, 1990.; Fahle i sur., 2020.).
Enzimi poput hidrolaza (esteraze, amidaze) su druga važna klasa enzima koji koriste vodu za cijepanje kovalentnih veza i pokazuju široku specifičnost supstrata. Karbaril hidrolaza i druge hidrolaze smatraju se komponentama periplazme (transmembrane) kod gram-negativnih bakterija (Kamini i sur., 2018.). Karbaril ima i amidnu i estersku vezu; stoga ga može hidrolizirati esteraza ili amidaza da bi se formirao 1-naftol. Izviješteno je da karbaril u soju Rhizobium rhizobium AC10023 i soju Arthrobacter RC100 funkcionira kao esteraza odnosno amidaza. Karbaril u soju Arthrobacter RC100 također funkcionira kao amidaza. Pokazalo se da RC100 hidrolizira četiri insekticida klase N-metilkarbamata kao što su karbaril, metomil, mefenaminska kiselina i XMC (Hayaatsu i sur., 2001.). Izviješteno je da CH u Pseudomonas sp. C5pp može djelovati na karbaril (100% aktivnosti) i 1-naftil acetat (36% aktivnosti), ali ne i na 1-naftilacetamid, što ukazuje na to da je riječ o esterazi (Trivedi i sur., 2016).
Biokemijske studije, obrasci regulacije enzima i genetska analiza pokazali su da se geni za razgradnju naftalena sastoje od dvije inducibilne regulatorne jedinice ili „operona“: nah („uzvodni put“, koji pretvara naftalen u salicilnu kiselinu) i sal („nizvodni put“, koji pretvara salicilnu kiselinu u središnji ugljikov put putem katehola). Salicilna kiselina i njezini analozi mogu djelovati kao induktori (Shamsuzzaman i Barnsley, 1974). U prisutnosti glukoze ili organskih kiselina, operon je potisnut. Slika 5 prikazuje potpunu genetsku organizaciju razgradnje naftalena (u obliku operona). Opisano je nekoliko imenovanih varijanti/oblika gena nah (ndo/pah/dox) i utvrđeno je da imaju visoku homologiju sekvenci (90%) među svim vrstama Pseudomonas (Abbasian i sur., 2016). Geni uzvodnog puta naftalena općenito su raspoređeni konsenzusnim redoslijedom kao što je prikazano na slici 5A. Za drugi gen, nahQ, također je utvrđeno da je uključen u metabolizam naftalena i obično se nalazio između nahC i nahE, ali njegova stvarna funkcija tek treba biti razjašnjena. Slično tome, gen nahY, odgovoran za kemotaksiju osjetljivu na naftalen, pronađen je na distalnom kraju nah operona kod nekih članova. Kod Ralstonia sp., gen U2 koji kodira glutation S-transferazu (gsh) pronađen je između nahAa i nahAb, ali nije utjecao na karakteristike iskorištavanja naftalena (Zylstra i sur., 1997.).
Slika 5. Genetska organizacija i raznolikost uočena tijekom razgradnje naftalena među bakterijskim vrstama; (A) Gornji naftalenski put, metabolizam naftalena u salicilnu kiselinu; (B) Donji naftalenski put, salicilna kiselina putem katehola do središnjeg ugljikovog puta; (C) salicilna kiselina putem gentizata do središnjeg ugljikovog puta.
„Donji put“ (sal operon) obično se sastoji od nahGTHINLMOKJ i pretvara salicilat u piruvat i acetaldehid putem puta cijepanja katehol metaringa. Utvrđeno je da je gen nahG (koji kodira salicilat hidroksilazu) očuvan na proksimalnom kraju operona (slika 5B). U usporedbi s drugim sojevima koji razgrađuju naftalen, u P. putida CSV86 nah i sal operoni su tandemski i vrlo blisko povezani (oko 7,5 kb). U nekim gram-negativnim bakterijama, kao što su Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 i P. putida AK5, naftalen se metabolizira kao središnji ugljikov metabolit putem gentizatnog puta (u obliku sgp/nag operona). Genska kaseta je tipično predstavljena u obliku nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, gdje se nagR (koji kodira regulator tipa LysR) nalazi na gornjem kraju (Slika 5C).
Karbaril ulazi u središnji ugljikov ciklus putem metabolizma 1-naftola, 1,2-dihidroksinaftalena, salicilne kiseline i gentizinske kiseline (Slika 3). Na temelju genetskih i metaboličkih studija predloženo je da se ovaj put podijeli na „uzvodni“ (konverzija karbarila u salicilnu kiselinu), „srednji“ (konverzija salicilne kiseline u gentizinsku kiselinu) i „nizvodni“ (konverzija gentizinske kiseline u međuprodukte središnjeg ugljikovog puta) (Singh i sur., 2013.). Genomska analiza C5pp (superkontig A, 76,3 kb) otkrila je da je gen mcbACBDEF uključen u pretvorbu karbarila u salicilnu kiselinu, nakon čega slijedi mcbIJKL u pretvorbi salicilne kiseline u gentizinsku kiselinu, te mcbOQP u pretvorbi gentizinske kiseline u središnje ugljikove međuprodukte (fumarat i piruvat, Trivedi i sur., 2016.) (Slika 6).
Izviješteno je da enzimi uključeni u razgradnju aromatskih ugljikovodika (uključujući naftalen i salicilnu kiselinu) mogu biti inducirani odgovarajućim spojevima, a inhibirani jednostavnim izvorima ugljika poput glukoze ili organskih kiselina (Shingler, 2003.; Phale i sur., 2019., 2020.). Među različitim metaboličkim putovima naftalena i njegovih derivata, regulatorna svojstva naftalena i karbarila su donekle proučavana. Za naftalen, gene i u uzvodnim i nizvodnim putovima regulira NahR, trans-aktivirajući pozitivni regulator tipa LysR. Potreban je za indukciju gena nah salicilnom kiselinom i njegovu naknadnu ekspresiju na visokoj razini (Yen i Gunsalus, 1982.). Nadalje, studije su pokazale da su integrativni faktor domaćina (IHF) i XylR (sigma 54-ovisni transkripcijski regulator) također ključni za transkripcijsku aktivaciju gena u metabolizmu naftalena (Ramos i sur., 1997.). Studije su pokazale da se enzimi puta otvaranja katehol meta-prstenova, naime katehol 2,3-dioksigenaza, induciraju u prisutnosti naftalena i/ili salicilne kiseline (Basu i sur., 2006.). Studije su pokazale da se enzimi puta otvaranja katehol orto-prstenova, naime katehol 1,2-dioksigenaza, induciraju u prisutnosti benzojeve kiseline i cis,cis-mukonata (Parsek i sur., 1994.; Tover i sur., 2001.).
U soju C5pp, pet gena, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR i mcbS, kodiraju regulatore koji pripadaju obitelji transkripcijskih regulatora LysR/TetR odgovornih za kontrolu razgradnje karbarila. Utvrđeno je da je homologni gen mcbG najuže povezan s regulatorom tipa LysR, PhnS (58% identiteta aminokiselina) koji je uključen u metabolizam fenantrena u Burkholderia RP00725 (Trivedi i sur., 2016). Utvrđeno je da je gen mcbH uključen u međuput (konverzija salicilne kiseline u gentizinsku kiselinu) i pripada transkripcijskom regulatoru tipa LysR, NagR/DntR/NahR u Pseudomonas i Burkholderia. Izviješteno je da članovi ove porodice prepoznaju salicilnu kiselinu kao specifičnu efektorsku molekulu za indukciju gena razgradnje. S druge strane, tri gena, mcbN, mcbR i mcbS, koji pripadaju transkripcijskim regulatorima tipa LysR i TetR, identificirani su u nizvodnom putu (metaboliti gentizat-centralnog ugljikovog puta).
U prokariotima, horizontalni procesi prijenosa gena (akvizicija, zamjena ili prijenos) putem plazmida, transpozona, profaga, genomskih otoka i integrativnih konjugativnih elemenata (ICE) glavni su uzroci plastičnosti u bakterijskim genomima, što dovodi do stjecanja ili gubitka specifičnih funkcija/svojstava. To omogućuje bakterijama brzu prilagodbu različitim uvjetima okoliša, pružajući potencijalne adaptivne metaboličke prednosti domaćinu, poput razgradnje aromatskih spojeva. Metaboličke promjene često se postižu finim podešavanjem degradacijskih operona, njihovih regulatornih mehanizama i specifičnosti enzima, što olakšava razgradnju šireg raspona aromatskih spojeva (Nojiri i sur., 2004.; Phale i sur., 2019., 2020.). Utvrđeno je da se genske kasete za razgradnju naftalena nalaze na raznim mobilnim elementima kao što su plazmidi (konjugativni i nekonjugativni), transpozoni, genomi, ICE-ovi i kombinacije različitih bakterijskih vrsta (Slika 5). U Pseudomonas G7, nah i sal operoni plazmida NAH7 transkribiraju se u istoj orijentaciji i dio su defektnog transpozona kojem je za mobilizaciju potrebna transpozaza Tn4653 (Sota i sur., 2006.). U soju Pseudomonas NCIB9816-4, gen je pronađen na konjugativnom plazmidu pDTG1 kao dva operona (udaljena približno 15 kb) koji su transkribirani u suprotnim smjerovima (Dennis i Zylstra, 2004.). U soju Pseudomonas putida AK5, nekonjugativni plazmid pAK5 kodira enzim odgovoran za razgradnju naftalena putem gentizatnog puta (Izmalkova i sur., 2013.). U soju Pseudomonas PMD-1, nah operon se nalazi na kromosomu, dok se sal operon nalazi na konjugativnom plazmidu pMWD-1 (Zuniga i sur., 1981.). Međutim, kod Pseudomonas stutzeri AN10, svi geni za razgradnju naftalena (operoni nah i sal) nalaze se na kromosomu i vjerojatno se regrutiraju putem transpozicije, rekombinacije i preuređenja (Bosch i sur., 2000.). Kod Pseudomonas sp. CSV86, operoni nah i sal nalaze se u genomu u obliku ICE (ICECSV86). Struktura je zaštićena tRNAGly nakon čega slijede izravna ponavljanja koja ukazuju na mjesta rekombinacije/vezivanja (attR i attL) i fagu slična integraza smještena na oba kraja tRNAGly, dakle strukturno slična ICEclc elementu (ICEclcB13 kod Pseudomonas knackmusii za razgradnju klorokatehola). Izviješteno je da se geni na ICE mogu prenijeti konjugacijom s izuzetno niskom frekvencijom prijenosa (10-8), čime se svojstva razgradnje prenose na primatelja (Basu i Phale, 2008.; Phale i sur., 2019.).
Većina gena odgovornih za razgradnju karbarila nalazi se na plazmidima. Arthrobacter sp. RC100 sadrži tri plazmida (pRC1, pRC2 i pRC300) od kojih dva konjugirajuća plazmida, pRC1 i pRC2, kodiraju enzime koji pretvaraju karbaril u gentizat. S druge strane, enzimi uključeni u pretvorbu gentizata u središnje ugljikove metabolite nalaze se na kromosomu (Hayaatsu i sur., 1999.). Bakterije roda Rhizobium. Soj AC100, koji se koristi za pretvorbu karbarila u 1-naftol, sadrži plazmid pAC200, koji nosi gen cehA koji kodira CH kao dio Tnceh transpozona okruženog sekvencama sličnim insercijskim elementima (istA i istB) (Hashimoto i sur., 2002.). U soju Sphingomonas CF06, vjeruje se da je gen za razgradnju karbarila prisutan u pet plazmida: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 i pCF05. Homologija DNA ovih plazmida je visoka, što ukazuje na postojanje duplikacije gena (Feng i sur., 1997.). U simbiontu koji razgrađuje karbaril, sastavljenom od dvije vrste Pseudomonas, soj 50581 sadrži konjugativni plazmid pCD1 (50 kb) koji kodira gen za karbaril hidrolazu mcd, dok konjugativni plazmid u soju 50552 kodira enzim koji razgrađuje 1-naftol (Chapalamadugu i Chaudhry, 1991.). U soju Achromobacter WM111, gen za furadan hidrolazu mcd nalazi se na plazmidu od 100 kb (pPDL11). Pokazano je da je ovaj gen prisutan na različitim plazmidima (100, 105, 115 ili 124 kb) u različitim bakterijama iz različitih geografskih regija (Parekh i sur., 1995.). Kod Pseudomonas sp. C5pp, svi geni odgovorni za razgradnju karbarila nalaze se u genomu koji obuhvaća 76,3 kb sekvence (Trivedi i sur., 2016.). Analiza genoma (6,15 Mb) otkrila je prisutnost 42 MGE i 36 GEI, od kojih se 17 MGE nalazilo u superkontigu A (76,3 kb) s prosječnim asimetričnim sadržajem G+C (54–60 mol%), što sugerira moguće horizontalne događaje prijenosa gena (Trivedi i sur., 2016.). P. putida XWY-1 pokazuje sličan raspored gena koji razgrađuju karbaril, ali ti se geni nalaze na plazmidu (Zhu i sur., 2019.).
Osim metaboličke učinkovitosti na biokemijskoj i genomskoj razini, mikroorganizmi pokazuju i druga svojstva ili odgovore poput kemotaksije, svojstava modifikacije stanične površine, kompartmentalizacije, preferencijalnog iskorištavanja, proizvodnje biosurfaktanta itd., što im pomaže da učinkovitije metaboliziraju aromatske zagađivače u kontaminiranim okolišima (Slika 7).
Slika 7. Različite strategije staničnog odgovora idealnih bakterija koje razgrađuju aromatske ugljikovodike za učinkovitu biorazgradnju stranih spojeva zagađivača.
Kemotaktički odgovori smatraju se čimbenicima koji pojačavaju razgradnju organskih onečišćujućih tvari u heterogeno onečišćenim ekosustavima. (2002.) pokazali su da kemotaksija Pseudomonas sp. G7 na naftalen povećava brzinu razgradnje naftalena u vodenim sustavima. Divlji tip soja G7 razgradio je naftalen mnogo brže od mutantnog soja s nedostatkom kemotaksije. Utvrđeno je da je protein NahY (538 aminokiselina s membranskom topologijom) ko-transkribiran s genima metaklavažnog puta na plazmidu NAH7, i poput kemotaktičkih transduktora, čini se da ovaj protein funkcionira kao kemoreceptor za razgradnju naftalena (Grimm i Harwood 1997.). Druga studija Hansela i suradnika (2009.) pokazala je da je protein kemotaktički, ali je njegova brzina razgradnje visoka. (2011.) pokazali su kemotaktički odgovor Pseudomonas (P. putida) na plinoviti naftalen, pri čemu je difuzija u plinovitoj fazi rezultirala stalnim protokom naftalena u stanice, što je kontroliralo kemotaktički odgovor stanica. Istraživači su iskoristili ovo kemotaktično ponašanje kako bi stvorili mikrobe koji bi povećali brzinu razgradnje. Studije su pokazale da kemosenzorni putevi također reguliraju druge stanične funkcije poput stanične diobe, regulacije staničnog ciklusa i stvaranja biofilma, čime pomažu u kontroli brzine razgradnje. Međutim, iskorištavanje ovog svojstva (kemotaksije) za učinkovitu razgradnju otežano je nekoliko uskih grla. Glavne prepreke su: (a) različiti paralogni receptori prepoznaju iste spojeve/ligande; (b) postojanje alternativnih receptora, tj. energetski tropizam; (c) značajne razlike u sekvencama u senzornim domenama iste obitelji receptora; i (d) nedostatak informacija o glavnim bakterijskim senzorskim proteinima (Ortega i sur., 2017.; Martin-Mora i sur., 2018.). Ponekad biorazgradnja aromatskih ugljikovodika proizvodi više metabolita/međuprodukata, koji mogu biti kemotaktični za jednu skupinu bakterija, ali odbojni za druge, što dodatno komplicira proces. Kako bismo identificirali interakcije liganada (aromatskih ugljikovodika) s kemijskim receptorima, konstruirali smo hibridne senzorske proteine ​​(PcaY, McfR i NahY) spajanjem senzorskih i signalnih domena Pseudomonas putida i Escherichia coli, koje ciljaju receptore za aromatske kiseline, TCA međuprodukte i naftalen (Luu i sur., 2019).
Pod utjecajem naftalena i drugih policikličkih aromatskih ugljikovodika (PAH), struktura bakterijske membrane i integritet mikroorganizama podliježu značajnim promjenama. Studije su pokazale da naftalen ometa interakciju acilnog lanca putem hidrofobnih interakcija, čime se povećava bubrenje i fluidnost membrane (Sikkema i sur., 1995.). Kako bi se suzbile s ovim štetnim učinkom, bakterije reguliraju fluidnost membrane promjenom omjera i sastava masnih kiselina između izo/anteizo masnih kiselina s razgranatim lancem i izomerizacijom cis-nezasićenih masnih kiselina u odgovarajuće trans-izomere (Heipieper i de Bont, 1994.). Kod Pseudomonas stutzeri uzgojenog na tretmanu naftalenom, omjer zasićenih i nezasićenih masnih kiselina povećao se s 1,1 na 2,1, dok se kod Pseudomonas JS150 taj omjer povećao sa 7,5 na 12,0 (Mrozik i sur., 2004.). Kada su uzgajane na naftalenu, stanice Achromobacter KAs 3–5 pokazale su agregaciju stanica oko kristala naftalena i smanjenje naboja stanice (s -22,5 na -2,5 mV) popraćeno citoplazmatskom kondenzacijom i vakuolizacijom, što ukazuje na promjene u staničnoj strukturi i svojstvima stanične površine (Mohapatra i sur., 2019.). Iako su stanične/površinske promjene izravno povezane s boljim unosom aromatskih onečišćujućih tvari, relevantne strategije bioinženjeringa nisu temeljito optimizirane. Manipulacija oblikom stanice rijetko se koristila za optimizaciju bioloških procesa (Volke i Nikel, 2018.). Brisanje gena koji utječu na diobu stanica uzrokuje promjene u morfologiji stanica. Brisanje gena koji utječu na diobu stanica uzrokuje promjene u morfologiji stanica. Kod Bacillus subtilis, pokazalo se da je protein stanične septuma SepF uključen u stvaranje septuma i potreban je za sljedeće korake stanične diobe, ali nije esencijalni gen. Brisanje gena koji kodiraju peptidne glikanske hidrolaze u Bacillus subtilis rezultiralo je izduživanjem stanica, povećanom specifičnom brzinom rasta i poboljšanim kapacitetom proizvodnje enzima (Cui i sur., 2018.).
Predložena je kompartmentalizacija puta razgradnje karbarila kako bi se postigla učinkovita razgradnja sojeva Pseudomonas C5pp i C7 (Kamini i sur., 2018.). Pretpostavlja se da se karbaril transportira u periplazmatski prostor kroz septum vanjske membrane i/ili kroz difuzibilne porine. CH je periplazmatski enzim koji katalizira hidrolizu karbarila u 1-naftol, koji je stabilniji, hidrofobniji i toksičniji. CH je lokaliziran u periplazmi i ima nizak afinitet za karbaril, kontrolirajući tako stvaranje 1-naftola, čime sprječava njegovo nakupljanje u stanicama i smanjuje njegovu toksičnost za stanice (Kamini i sur., 2018.). Rezultirajući 1-naftol se transportira u citoplazmu preko unutarnje membrane particioniranjem i/ili difuzijom, a zatim se hidroksilira u 1,2-dihidroksinaftalen pomoću enzima 1NH visokog afiniteta za daljnji metabolizam u središnjem ugljikovom putu.
Iako mikroorganizmi imaju genetske i metaboličke sposobnosti za razgradnju ksenobiotičkih izvora ugljika, hijerarhijska struktura njihovog korištenja (tj. preferencijalno korištenje jednostavnih u odnosu na složene izvore ugljika) glavna je prepreka biorazgradnji. Prisutnost i korištenje jednostavnih izvora ugljika smanjuje gene koji kodiraju enzime koji razgrađuju složene/nepreferirane izvore ugljika poput PAH-ova. Dobro proučen primjer je da kada se glukoza i laktoza istovremeno daju Escherichia coli, glukoza se učinkovitije koristi od laktoze (Jacob i Monod, 1965). Izviješteno je da Pseudomonas razgrađuje razne PAH-ove i ksenobiotičke spojeve kao izvore ugljika. Hijerarhija korištenja izvora ugljika kod Pseudomonasa je organske kiseline > glukoza > aromatski spojevi (Hylemon i Phibbs, 1972; Collier i sur., 1996). Međutim, postoji iznimka. Zanimljivo je da Pseudomonas sp. CSV86 pokazuje jedinstvenu hijerarhijsku strukturu koja preferencijalno koristi aromatske ugljikovodike (benzojeva kiselina, naftalen itd.) umjesto glukoze i kometabolizira aromatske ugljikovodike s organskim kiselinama (Basu i sur., 2006.). Kod ove bakterije, geni za razgradnju i transport aromatskih ugljikovodika nisu smanjeno regulirani čak ni u prisutnosti drugog izvora ugljika poput glukoze ili organskih kiselina. Kada se uzgaja u mediju s glukozom i aromatskim ugljikovodicima, uočeno je da su geni za transport i metabolizam glukoze smanjeno regulirani, aromatski ugljikovodici korišteni su u prvoj log fazi, a glukoza u drugoj log fazi (Basu i sur., 2006.; Choudhary i sur., 2017.). S druge strane, prisutnost organskih kiselina nije utjecala na ekspresiju metabolizma aromatskih ugljikovodika, pa se očekuje da će ova bakterija biti kandidatski soj za studije biorazgradnje (Phale i sur., 2020.).
Dobro je poznato da biotransformacija ugljikovodika može uzrokovati oksidativni stres i pojačanu regulaciju antioksidativnih enzima u mikroorganizmima. Neučinkovita biodegradacija naftalena, kako u stanicama stacionarne faze, tako i u prisutnosti toksičnih spojeva, dovodi do stvaranja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) (Kang i sur. 2006.). Budući da enzimi koji razgrađuju naftalen sadrže željezo-sumporne klastere, pod oksidativnim stresom, željezo u hemu i željezo-sumpornim proteinima bit će oksidirano, što dovodi do inaktivacije proteina. Ferredoksin-NADP+ reduktaza (Fpr), zajedno sa superoksid dismutazom (SOD), posreduje u reverzibilnoj redoks reakciji između NADP+/NADPH i dvije molekule feredoksina ili flavodoksina, čime se uklanja ROS i obnavlja željezo-sumporni centar pod oksidativnim stresom (Li i sur. 2006.). Izviješteno je da i Fpr i SodA (SOD) kod Pseudomonas mogu biti inducirani oksidativnim stresom, a povećana aktivnost SOD i katalaze uočena je kod četiri soja Pseudomonas (O1, W1, As1 i G1) tijekom rasta u uvjetima dodanog naftalena (Kang i sur., 2006.). Studije su pokazale da dodatak antioksidansa poput askorbinske kiseline ili željeza (Fe2+) može povećati brzinu rasta naftalena. Kada je Rhodococcus erythropolis rastao u naftalenskom mediju, transkripcija gena citokroma P450 povezanih s oksidativnim stresom, uključujući sodA (Fe/Mn superoksid dismutaza), sodC (Cu/Zn superoksid dismutaza) i recA, bila je povećana (Sazykin i sur., 2019.). Komparativna kvantitativna proteomska analiza stanica Pseudomonas kultiviranih u naftalenu pokazala je da je pojačana regulacija različitih proteina povezanih s odgovorom na oksidativni stres strategija suočavanja sa stresom (Herbst i sur., 2013.).
Zabilježeno je da mikroorganizmi proizvode biosurfaktante pod djelovanjem hidrofobnih izvora ugljika. Ovi surfaktanti su amfifilni površinski aktivni spojevi koji mogu formirati agregate na granicama ulje-voda ili zrak-voda. To potiče pseudo-solubilizaciju i olakšava adsorpciju aromatskih ugljikovodika, što rezultira učinkovitom biodegradacijom (Rahman i sur., 2002.). Zbog tih svojstava, biosurfaktanti se široko koriste u raznim industrijama. Dodavanje kemijskih surfaktanata ili biosurfaktanata bakterijskim kulturama može poboljšati učinkovitost i brzinu razgradnje ugljikovodika. Među biosurfaktantima, ramnolipidi koje proizvodi Pseudomonas aeruginosa opsežno su proučavani i karakterizirani (Hisatsuka i sur., 1971.; Rahman i sur., 2002.). Osim toga, druge vrste biosurfaktanata uključuju lipopeptide (mucine iz Pseudomonas fluorescens), emulgator 378 (iz Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg i Ron, 1999.), trehaloza disaharid lipide iz Rhodococcus (Ramdahl, 1985.), lihenin iz Bacillusa (Saraswathy i Hallberg, 2002.) i surfaktant iz Bacillus subtilis (Siegmund i Wagner, 1991.) i Bacillus amyloliquefaciens (Zhi i sur., 2017.). Pokazalo se da ovi snažni surfaktanti smanjuju površinsku napetost sa 72 dyna/cm na manje od 30 dyna/cm, što omogućuje bolju apsorpciju ugljikovodika. Izviješteno je da Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia i druge bakterijske vrste mogu proizvoditi različite biosurfaktante na bazi ramnolipida i glikolipida kada se uzgajaju u naftalenskim i metilnaftalenskim medijima (Kanga i sur., 1997.; Puntus i sur., 2005.). Pseudomonas maltophilia CSV89 može proizvoditi izvanstanični biosurfaktant Biosur-Pm kada se uzgaja na aromatskim spojevima poput naftojeve kiseline (Phale i sur., 1995.). Kinetika stvaranja Biosur-Pm pokazala je da je njegova sinteza proces ovisan o rastu i pH. Utvrđeno je da je količina Biosur-Pm koju proizvode stanice pri neutralnom pH bila veća nego pri pH 8,5. Stanice uzgojene pri pH 8,5 bile su hidrofobnije i imale su veći afinitet za aromatske i alifatske spojeve od stanica uzgojenih pri pH 7,0. U Rhodococcus spp. N6, viši omjer ugljika i dušika (C:N) i ograničenje željeza optimalni su uvjeti za proizvodnju izvanstaničnih biosurfaktanata (Mutalik i sur., 2008.). Učinjeni su pokušaji poboljšanja biosinteze biosurfaktanata (surfaktina) optimizacijom sojeva i fermentacije. Međutim, titar surfaktanata u mediju za kulturu je nizak (1,0 g/L), što predstavlja izazov za proizvodnju velikih razmjera (Jiao i sur., 2017.; Wu i sur., 2019.). Stoga su korištene metode genetskog inženjeringa za poboljšanje njegove biosinteze. Međutim, njegova inženjerska modifikacija je teška zbog velike veličine operona (∼25 kb) i složene biosintetske regulacije sustava kvorumskog osjećanja (Jiao i sur., 2017.; Wu i sur., 2019.). Na bakterijama Bacillus proveden je niz modifikacija genetskim inženjeringom, uglavnom s ciljem povećanja proizvodnje surfaktina zamjenom promotora (srfA operona), prekomjernom ekspresijom proteina za izvoz surfaktina YerP te regulatornih faktora ComX i PhrC (Jiao i sur., 2017.). Međutim, ove metode genetskog inženjeringa postigle su samo jednu ili nekoliko genetskih modifikacija i još nisu dosegle komercijalnu proizvodnju. Stoga je potrebno daljnje proučavanje metoda optimizacije temeljenih na znanju.
Studije biorazgradnje PAH-ova uglavnom se provode u standardnim laboratorijskim uvjetima. Međutim, na kontaminiranim mjestima ili u kontaminiranim okolišima, pokazalo se da mnogi abiotički i biotički čimbenici (temperatura, pH, kisik, dostupnost hranjivih tvari, bioraspoloživost supstrata, drugi ksenobiotici, inhibicija krajnjeg produkta itd.) mijenjaju i utječu na razgradni kapacitet mikroorganizama.
Temperatura ima značajan utjecaj na biorazgradnju PAH-ova. S porastom temperature, koncentracija otopljenog kisika se smanjuje, što utječe na metabolizam aerobnih mikroorganizama, budući da im je potreban molekularni kisik kao jedan od supstrata za oksigenaze koje provode reakcije hidroksilacije ili cijepanja prstena. Često se napominje da povišena temperatura pretvara matične PAH-ove u toksičnije spojeve, čime se inhibira biorazgradnja (Muller i sur., 1998.).
Primijećeno je da mnoga mjesta kontaminirana PAH-ovima imaju ekstremne pH vrijednosti, poput mjesta kontaminiranih kiselim rudničkim odvodima (pH 1–4) i mjesta uplinjavanja prirodnog plina/ugljena kontaminirana alkalnom procjednom vodom (pH 8–12). Ovi uvjeti mogu ozbiljno utjecati na proces biorazgradnje. Stoga se prije korištenja mikroorganizama za bioremedijaciju preporučuje podešavanje pH vrijednosti dodavanjem prikladnih kemikalija (s umjerenim do vrlo niskim oksidacijsko-redukcijskim potencijalom) poput amonijevog sulfata ili amonijevog nitrata za alkalna tla ili kalcifikacije kalcijevim karbonatom ili magnezijevim karbonatom za kisela mjesta (Bowlen i sur. 1995.; Gupta i Sar 2020.).
Opskrba kisikom zahvaćenog područja ograničavajući je faktor brzine biodegradacije PAH-ova. Zbog redoks uvjeta okoliša, procesi bioremedijacije in situ obično zahtijevaju uvođenje kisika iz vanjskih izvora (obrada tla, propuhivanje zrakom i dodavanje kemikalija) (Pardieck i sur., 1992.). Odenkranz i sur. (1996.) pokazali su da dodavanje magnezijevog peroksida (spoja koji oslobađa kisik) u onečišćeni vodonosnik može učinkovito bioremedijirati BTEX spojeve. Druga studija istraživala je in situ razgradnju fenola i BTEX-a u onečišćenom vodonosniku ubrizgavanjem natrijevog nitrata i izgradnjom bunara za ekstrakciju kako bi se postigla učinkovita bioremedijacija (Bewley i Webb, 2001.).