Danas†Trenutna adresa: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Centar za elektroničko biološko snimanje.
Kompleks 1 za sakupljanje svjetlosti (RC-LH1) reakcijskog centra je glavna fotosintetska komponenta ljubičastih fototrofnih bakterija. Predstavili smo dvije krioelektronsko-mikroskopske strukture RC-LH1 kompleksa iz Rhodopseudomonas palustris. Struktura RC-LH114-W kompleksa rezolucije 2,65 Å sastoji se od 14 podjedinica LH1 petlji koje okružuju RC, koji je prekinut proteinom W, dok je kompleks bez proteina W potpuno RC sastava okružen RC. Zatvorena LH1 petlja od 16 podjedinica. Usporedba ovih struktura pruža uvid u dinamiku kinona u RC-LH1 kompleksu, uključujući prethodno neodređene konformacijske promjene pri vezanju kinona na RC QB mjesto, kao i lokaciju pomoćnih mjesta vezanja kinona, koja pomažu u njihovom prijenosu na RC. Jedinstvena struktura W proteina sprječava zatvaranje LH1 petlje, čime se stvara kanal za ubrzavanje izmjene kinona/kinolona.
Energija koju osigurava fotosinteza može održavati gotovo sav život na Zemlji i ima veliki potencijal za solarnu biotehnologiju. Dok potiču globalnu fotosintezu, ljubičaste fototrofne bakterije također pokazuju različite energetske načine i metaboličke sposobnosti. Mogu izbjeći fotosintezu i rasti kao heterotrofne bakterije u mraku, mogu fiksirati dušik i ugljikov dioksid, proizvoditi vodik i razgrađivati ​​aromatske spojeve (1-3). Kako bi se osigurala energija za ove procese, svjetlost se mora brzo i učinkovito pretvoriti u kemijsku energiju. Ovaj proces započinje kada kompleks antene za hvatanje svjetlosti apsorbira svjetlost i prenosi zarobljenu energiju u reakcijski centar (RC), čime se pokreće razdvajanje naboja (4-7). Osnovna jedinica fotosinteze u ljubičastim fototrofnim bakterijama sastoji se od RC tipa 2, okruženog kompleksom za sakupljanje svjetlosti 1 (LH1), koji tvori jezgru kompleksa RC-LH1. LH1 tvori niz zakrivljenih αβ heterodimera, od kojih svaki veže dvije molekule bakterijskog klorofila (BChl) a i jedan ili dva karotenoida (8-12). Najjednostavnija LH1 antena sastoji se od 16 ili 17 αβ heterodimera koji okružuju RC (9-13) u zatvorenoj petlji, ali u drugim središnjim kompleksima, transmembranski peptidi prekidaju kontinuitet okolnog LH1, čime potiču difuziju kinola/kinona između RC i citokroma bc1 kompleksa (11, 13-15). Ljubičasta fototrofna biljka Rhodopseudomonas (Rps.) je modelni organizam koji može razumjeti prijenos energije i elektrona koji podržava fotosintezu. Prva kristalna struktura Rps. Model palustris RC-LH1 kompleksa je RC, okružen s 15 heterodimernih LH1 petlji, koje prekida nepoznati protein nazvan "Protein W" (14). Protein-W je naknadno identificiran kao RPA4402, što je nekarakterizirani protein od 10,5 kDa s tri predviđene transmembranske uzvojnice (TMH) (16). Predlažemo preimenovati gen rpa4402 koji kodira protein W u pufW kako bi bio u skladu s nomenklaturom koja se koristi za gene koji kodiraju RC-L, M (pufL, pufM) i LH1α, β (pufA, pufB) podjedinice. Zanimljivo je da je protein-W prisutan samo u oko 10% RC-LH1, što otkriva da Rps. palustris proizvodi dva različita RC-LH1 kompleksa. Ovdje izvještavamo o visokorezolucijskim krio-EM (cryo-EM) strukturama dvaju osnovnih kompleksa, jednom s proteinom W i 14 αβ heterodimera, a drugom bez proteina W i zatvorenom LH1 petljom od 16 heterodimera. Naša struktura predstavlja korak naprijed u razumijevanju RC-LH1 kompleksa Rps. palustris, jer smo analizirali homogenu populaciju svake varijante i imamo dovoljnu rezoluciju da jasno dodijelimo svaki peptid i vezane pigmente te srodne lipide i kinone. Usporedba ovih struktura pokazuje da tri TMH proteina-W, koja do sada nisu pronađena ni u jednom drugom RC-LH1 kompleksu, generiraju kinonski kanal kako bi ubrzali izmjenu kinona/kinolona. Identificiran je niz konzerviranih mjesta vezanja lipida i kinona, a otkrili smo i novu konformacijsku promjenu nakon kombinacije kinona i RC, koja bi mogla biti prikladna za RC fotosustava II (PSII) oksigeniranih fototrofnih organizama. Naši nalazi pružaju nove uvide u kinetiku vezanja i izmjene kinona/kinolona u RC-LH1 jezgri ljubičastih fototrofnih bakterija.
Kako bismo olakšali detaljno proučavanje dvaju kompleksa pronađenih u Rps. palustris, izolirali smo svaki RC-LH1 biokemijskim metodama. Kompleks s nedostatkom proteina W (u daljnjem tekstu ΔpufW) pročišćen je iz soja kojem nedostaje gen pufW (16), a može se proizvesti samo jedan RC-LH1 kompleks. Kompleks koji sadrži protein W proizvodi soj. Protein W ovog soja modificiran je s 10x His oznakom na svom C-terminusu, tako da se kompleks koji sadrži protein W može učinkovito kombinirati s proteinom W kojem najviše nedostaje imobilizacijom metala. Kompleks se učinkovito odvaja (16) afinitetnom kromatografijom (IMAC).
Kao što je prikazano na Slici 1, oba kompleksa sadrže RC s tri podjedinice (RC-L, RC-M i RC-H) okružene LH1 antenom. Struktura od 2,80 Å kompleksa kojem nedostaje protein-W pokazuje 16 αβ heterodimera, koji tvore zatvorenu LH1 petlju koja potpuno okružuje RC, u daljnjem tekstu RC-LH116 kompleks. Struktura od 2,65 Å kompleksa koji sadrži protein-W ima 14-heterodimer LH1 prekinut proteinom-W, u daljnjem tekstu RC-LH114-W.
(A i B) Površinski prikaz spoja. (C i D) Vezani pigmenti izraženi u štapićima. (E i F) Kompleksi promatrani s citoplazmatske površine imaju peptide i LH1 podjedinice prikazane u crtežima, a numerirani su u smjeru kazaljke na satu od protein-W jaza [u skladu s numeriranjem Rba. sphaeroides kompleks (13)]. Za LH1-α, boja proteinske podjedinice je žuta; za LH1-β, boja proteinske podjedinice je plava; za protein-W, protein je crven; za RC-H, cijan; za RC-L, narančasta; za RC-M, magenta. Kofaktori su predstavljeni štapićima, zelena predstavlja molekule BChl i BPh a, ljubičasta predstavlja karotenoide, a žuta predstavlja molekule UQ10. (G i H) Uvećani prikaz protein-W jaza u ekvivalentnom području RC-LH114-W kompleksa (G) i RC-LH116 kompleksa (H). Kofaktori su prikazani u obliku popunjavanja prostora, kelirani kinon je prikazan plavom bojom. Praznina protein-W je označena plavom isprekidanom linijom u (G), a male rupe gdje kinon/kinolol difundira na LH116 prstenu su označene crnom isprekidanom linijom u (H).
Slika 1 (A i B) prikazuje RC okružen otvorenim ili zatvorenim nizovima LH1αβ heterodimera, od kojih svaki veže dva BChl i jedan karotenoid (Slika 1, C i D). Prethodne studije su pokazale da je Rps LH1 kompleks. U biosintetskom putu spirulina ksantina, ove vrste sadrže mješovite populacije karotenoida (17). Međutim, spiropiroksantin je dominantni karotenoid i njegova gustoća je zadovoljavajuća. Stoga smo odlučili modelirati spiroksantin na svim mjestima vezanja LH1. Alfa i beta polipeptidi su pojedinačni TMH s kratkim vanjskim regijama membrane (Slika 1, A, B, E i F). Iako gustoća 17 ostataka na C-terminusu nije uočena, alfa polipeptid je cijepan od Met1 do Ala46 u oba kompleksa. β polipeptid je reduciran od Gly4 do Tyr52 u RC-LH116 i od Ser5 do Tyr52 u RC-LH114-W. Nije uočena gustoća od 3 ili 4 N-terminalna ili 13 C-terminalna ostatka (Slika S1). Analiza masene spektrometrije miješanog RC-LH1 kompleksa pripremljenog iz soja divljeg tipa pokazala je da je nedostajuća regija rezultat heterolognog cijepanja ovih peptida (Slika S1 i S2). Također je uočena N-terminalna formilacija α-Met1 (f). Analiza je pokazala da se α-peptid sastoji od ostataka fMet1 do Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, a β-peptid od ostataka Ser2 do Ala53, što je u dobrom skladu s kartom gustoće EM-a na niskim temperaturama.
Koordinacija α-His29 i β-His36 čini BChls suprotstavljenima; svaki αβ heterodimer sastavlja se sa svojim susjedima kako bi formirao otvorenu petlju (RC-LH114-W) ili zatvorenu petlju (RC-LH116) oko RC ekscitonski spregnutog pigmentnog niza (Slika 1, C i D). U usporedbi s pojasom od 877 nm RC-LH114-W, apsorpcijski crveni pomak RC-LH116 na 880 nm iznosi 3 nm (Slika 2A). Međutim, spektar kružnog dikroizma gotovo je isti (Slika 2B), što ukazuje na to da iako postoji jasna razlika između otvorenih i zatvorenih petlji, lokalno okruženje BChls vrlo je slično. Apsorpcijski crveni pomak može biti rezultat smanjenog toplinskog gibanja i povećane stabilnosti na zatvorenoj petlji (18, 19), promjene u vezivanju pigmenata uzrokovane zatvorenom petljom (20, 21) ili kombinacije ova dva učinka (11).
(A) Apsorpcijski spektar ultraljubičastog/vidljivog/bliskog infracrvenog zračenja, čiji su vrhovi označeni odgovarajućim pigmentima i normalizirani na BPh vrh na 775 nm. (B) Spektar kružnog dikroizma normaliziran na apsorbanciju BChl na 805 nm. (C i D) Odabrani ΔA spektri iz vremenski razlučenih apsorpcijskih spektara RC-LH114-W kompleksa (C) i RC-LH116 kompleksa (D). Radi bolje usporedivosti, svi spektri su normalizirani na ∆A od −A pri 0,2 ps. (E) Brzina oksidacije citokroma c2 nakon ozračivanja u prisutnosti različitih koncentracija UQ2 (vidi sliku S8 za sirove podatke). (F) U stanicama uzgojenim pod svjetlom niskog, srednjeg ili visokog intenziteta (10, 30 ili 300 μMm-2 s-1), podjedinice proteina W i RC-L u pročišćenom kompleksu i omjer odvojenih membrana. Odredite razinu proteina elektroforezom na SDS-poliakrilamidnom gelu i imunotestom (vidi sliku S9 za sirove podatke). Odredite omjer u odnosu na pročišćeni RC-LH114-W kompleks. Stehiometrijski omjer RC-L i protein-W kompleksa je 1:1.
BChl-ovi na položaju 1 u deformiranoj αβ14 petlji RC-LH114-W (slika 1, A, C i E) su bliži primarnom donoru RC (P) za 6,8 Å nego ekvivalentni BChl-ovi u RC-LH116 (slika 1, B, D i F, te slika S3); međutim, kinetika tranzijentne apsorpcije dvaju kompleksa pokazuje da su za RC-LH114-W i RC-LH116 vremenske konstante prijenosa energije pobuđenja od LH1 do RC 40 ± 4 i 44 ± 3 ps (slika 2). , C i D, slika S4 i tablica S2). Također nema značajne razlike u elektroničkom prijenosu unutar RC (slika S5 i povezani dodatni tekst). Sumnjamo da je bliska podudarnost vremena prijenosa energije između LH1 i RC-P posljedica slične udaljenosti, kuta i potencijalne energije većine BChl-ova u dvije LH1 petlje. Čini se da istraživanje energetskog uzorka LH1 za postizanje minimalne udaljenosti nije brže od izravnog prijenosa energije s neoptimalnih mjesta na RC. Otvorena LH1 petlja u RC-LH114-W također može podlijegati beznačajnom toplinskom gibanju pri uvjetima niske temperature za strukturnu analizu, a postoji i dulja konformacija prstena αβ14 na sobnoj temperaturi od udaljenosti pigmentacije βBChls na položaju RC1.
Kompleks RC-LH116 sadrži 32 BChl-a i 16 karotenoida, a njegov ukupni raspored je isti kao onaj dobiven iz Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Banka proteinskih podataka (PDB) ID 5Y5S] (9), soja Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) i zelenih algi (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Nakon poravnanja, uočena su samo mala odstupanja u položajima αβ heterodimera, posebno 1-5, 15 i 16 (slika S6). Prisutnost proteina-W ima značajan utjecaj na strukturu LH1. Njegova tri TMH-a povezana su kratkim petljama, s N-terminalom na lumenskoj strani kompleksa i C-terminalom na citoplazmatskoj strani (slike 1A i 3, A do D). Protein-W je uglavnom hidrofoban (slika 3B), a TMH2 i TMH3 stupaju u interakciju s LH1αβ-14 stvarajući transmembransku površinu (slika 3, B i E do G). Sučelje se uglavnom sastoji od ostataka Phe, Leu i Val u transmembranskom području. Ovi ostaci su složeni s hidrofobnim aminokiselinama i αβ-14 pigmentima. Neki polarni ostaci također doprinose interakciji, uključujući vodikovu vezu između W-Thr68 i β-Trp42 na površini kompleksne šupljine (slika 3, F i G). Na površini citoplazme, Gln34 je uz keto skupinu αβ-14 karotenoida. Osim toga, molekula n-dodecil β-d-maltozida (β-DDM) je razdvojena, a njezin hidrofobni rep proširen je do sučelja između proteina-W i αβ-14, a lipidni rep može se nalaziti u tijelu. Također smo primijetili da su C-terminalne regije razlučivanja proteina W i RCH vrlo blizu, ali ne u okviru stvaranja specifičnih interakcija (Slika 1, A i E). Međutim, moguće su interakcije u nerazriješenim C-terminalnim aminokiselinama ova dva proteina, što bi moglo pružiti mehanizam za regrutiranje proteina-W tijekom sastavljanja RC-LH114-W kompleksa.
(A) Protein-W, koji je okrenut prema sučelju s LH1αβ14 u crtanom obliku, ima bočni lanac u obliku štapića (crveno), prikazan u dijelu dijagrama elektrostatskog potencijala (prozirna siva površina s razinom konture od 0,13). (B) Protein-W predstavljen hidrofobno obojenom površinom. Polarna i nabijena područja prikazana su cijan bojom, hidrofobna područja prikazana su bijelom, a jako hidrofobna područja prikazana su narančastom bojom. (C i D) Protein-W prikazan u crtanom prikazu, njegova orijentacija je ista kao u (A) (C) i rotiran je za 180° (D). Prema položaju u sekvenci, prepoznatljivi ostaci usvajaju shemu duginih boja, gdje je N-terminal plav, a C-terminal crven. (E) Protein-W u istom prikazu kao u (A), a ostaci na sučelju protein-W:LH1 predstavljeni su štapićima s pričvršćenim oznakama. (F) Protein-W je rotiran za 90° u odnosu na (E) i LH1αβ14 u crtanom prikazu i u odnosu na ostatke na sučelju u stupčastom prikazu. Previseći ostaci beta polipeptida su označeni. Kofaktor je prikazan kao traka koja odgovara boji slike 1, razgrađeni β-DDM je prikazan sivo, a kisik je prikazan crveno. (G) Pogled u (F) je zakrenut za 180°, s istaknutim ostacima označenog alfa polipeptida.
Protein-W zamjenjuje αβ heterodimer (15. na slici 1F), čime sprječava zatvaranje petlje i naginjanje prva tri αβ heterodimera. Uočeno je da je maksimalni kut nagiba prvog αβ-1 heterodimera u odnosu na normalu filma bio 25° do 29° (slika 1, A i E), što je nastalo nagibom αβ-1 od 2° do 8° u RC A oštrom kontrastu-LH116 (slika 1, B i F). Drugi i treći heterodimer nagnuti su pod kutovima od 12° do 22°, odnosno 5° do 10°. Zbog sterne smetnje RC, nagib αβ-1 ne uključuje drugi par αβ (koji odgovara 16. αβ na slici 1F), čime se formira jasan razmak u LH1 prstenu (slika 1, A i E). Zbog nedostatka dva αβ heterodimera, uz gubitak četiri BChl i dva karotenoida, nijedan od karotenoida se ne veže na uvijenu αβ-1 podjedinicu, što rezultira LH114-W prstenom koji sadrži 13 vegetarijanskih karotenoida i 28 BChl. Procjene lokalne rezolucije dvaju kompleksa u αβ1 do 7 regijama niže su od onih za ostatak LH1 petlje, što može odražavati inherentnu plastičnost LH1 podjedinice uz RC QB mjesto (Slika 4).
Slike RC-LH114-W (A i B) i RC-LH116 (C i D) prikazane su iz istog pogleda odozgo/bočnog pogleda (A i B) (A i C) i površine šupljine kao na Sl. 1. (B i D). Obojene tipke prikazane su s desne strane.
Jedini drugi karakteristični jezgreni kompleks sa stehiometrijskim omjerom 1:14 je dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Međutim, protein W i PufX nemaju očitu homologiju i imaju značajan utjecaj na svoje odgovarajuće LH1 strukture. PufX je jedan TMH s N-terminalnom citoplazmatskom domenom koja interagira s citoplazmatskom stranom RC-H podjedinice (13) na položaju koji odgovara Rps. palustris LH116αβ-16. PufX stvara kanal za izmjenu kinona/kinolona između RC-LH1 i citokroma bcl kompleksa i prisutan je u svim jezgrenim kompleksima Rba. sphaeroides (13). Iako se sučelje monomer-monomer nalazi u Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX nalazi se na položaju vezanja proteina W u RC-LH114-W, a jaz izazvan PufX-om i proteinom-W nalazi se na ekvivalentnom položaju (slika S7A). Jaz u RC-LH114-W također je poravnat s hipotetskim kinonskim kanalom (8) Pseudomonas rosea LH1, koji nastaje peptidima koji nisu povezani s proteinom W ili PufX-om (slika S7B). Osim toga, kinonski kanal u Blc. Smaragdno zeleni LH1 nastao isključivanjem jedne γ podjedinice (7) nalazi se na sličnom položaju (slika S7C). Iako posredovan različitim proteinima, pojava ovih kinonskih/kinololnih kanala na zajedničkom položaju u RC-LH1 kompleksu čini se primjerom konvergentne evolucije, što ukazuje na to da jaz koji stvara protein W može djelovati kao kinonski kanal.
Razmak u petlji LH114-W omogućuje stvaranje kontinuiranog membranskog područja između unutarnjeg prostora kompleksa RC-LH114-W i glavne membrane (Slika 1G), umjesto povezivanja dviju domena putem proteinske pore kao u proteinima. Kompleks RC-LH116 sličan je zatvorenom Tch. Igličastom kompleksu (22) (Slika 1H). Budući da je difuzija kinona kroz membranu brža od difuzije kroz uski proteinski kanal, otvorena petlja LH114-W može omogućiti brži promet RC-a od zatvorene petlje LH116, a difuzija kinona u RC može biti ograničenija. Kako bismo testirali utječe li protein W na pretvorbu kinona kroz RC, proveli smo test oksidacije citokroma na određenoj koncentraciji ubikinona 2 (UQ2) (analog prirodnog UQ10 s kraćim izoprenskim repom) (Slika 2E). Iako prisutnost keliranog kinona otežava točno određivanje prividne Michaelisove konstante (RC-LH114-W i RC-LH116 su prikladni za 0,2±0,1 μM odnosno 0,5±0,2 μM), maksimalna brzina RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) je 28±5% veća od RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
U početku smo procijenili da je protein-W prisutan u oko 10% jezgrenog kompleksa (16); ovdje su stope popunjenosti stanica rasta pri slabom, srednjem i jakom svjetlu 15±0,6%, 11±1% i 0,9±0,5% (Slika 2F). Kvantitativna usporedba masene spektrometrije pokazala je da dodatak histidinske oznake nije smanjio relativnu količinu proteina-W u usporedbi sa sojevima divljeg tipa (P = 0,59), tako da te razine nisu artefakt modificiranog proteina-W (Slika S10). Međutim, ova niska popunjenost proteina-W u kompleksu RC-LH1 može omogućiti nekim RC-ima da se ubrzano preokreću, čime se ublažava sporija izmjena kinona/kinolona u kompleksu RC-LH116. Primijetili smo da je stopa popunjenosti pri jakom svjetlu u suprotnosti s nedavnim transkriptomskim podacima, što ukazuje na to da se ekspresija gena pufW povećava pod jakim svjetlom (Slika S11) (23). Razlika između transkripcije pufW i ugradnje proteina-W u RC-LH1 kompleks je zbunjujuća i može odražavati složenu regulaciju proteina.
U RC-LH114-W, 6 kardiolipina (CDL), 7 fosfatidilkolina (POPC), 1 fosfatidilglicerol (POPG) i 29 β-DDM molekula su alocirane i modelirane u njemu 6 CDL-ova, 24 POPC-a, 2 POPG-a i 12 βDDM-a. RC-LH116 (Slika 5, A i B). U ove dvije strukture, CDL se gotovo nalazi na citoplazmatskoj strani kompleksa, dok su POPC, POPG i β-DDM uglavnom smješteni na luminalnoj strani. Dvije molekule lipida i deterdženta izolirane su u αβ-1 do αβ-6 regiji RC-LH114-W kompleksa (Slika 5A), a pet ih je izolirano u ekvivalentnoj regiji RC-LH116 (Slika 5B). Više lipida pronađeno je na drugoj strani kompleksa, uglavnom CDL, akumuliranih između RC i αβ-7 do αβ-13 (Slika 5, A i B). Drugi strukturno razdvojeni lipidi i deterdženti nalaze se izvan LH1 prstena, a dobro razdvojeni acilni lanci protežu se između LH1 podjedinica, okvirno označenih kao β-DDM u RC-LH114-W, a definiranih kao β-DDM u RC A smjesi β-DDM i POPC-LH116. Slični položaji kelirajućih lipida i deterdženata u našoj strukturi ukazuju na to da su to fiziološki relevantna mjesta vezanja (slika S12A). Položaji ekvivalentnih molekula u Tch također imaju dobru konzistentnost. Nježni i Trv. Soj 970 RC-LH1 (slika S12, B do E) (9, 12) i ostaci vodikovih veza lipidne glavne skupine pokazali su prilično dobru očuvanost u poravnanju sekvenci (slika S13), što ukazuje na to da Konzervirani CDL koji se veže na RC (24), ta mjesta mogu biti očuvana u RC-LH1 kompleksu.
(A i B) RC-LH114-W (A) i RC-LH116 (B) peptidi su prikazani crtanim slikama, a pigmenti su predstavljeni štapićima, koristeći shemu boja na Slici 1. Lipidi su prikazani crvenom bojom, a deterdženti sivom. UQ vezan na RC QA i QB mjesta je žut, dok je izolirani UQ plav. (C i D) Isti prikazi kao (A) i (B), s izostavljenim lipidima. (E do G) Uvećani prikaz Q1(E), Q2(F) i Q3(G) iz RC-LH116, s bočnim lancima koji utječu jedan na drugi. Vodikove veze su prikazane kao crne isprekidane linije.
U RC-LH116, i RC QA i QB UQ, koji sudjeluju u prijenosu elektrona u procesu razdvajanja naboja, razgrađuju se na svojim mjestima vezanja. Međutim, u RC-LH114-W, QB kinon nije razlučen i bit će detaljno raspravljen u nastavku. Osim QA i QB kinona, dvije kelirane UQ molekule (smještene između RC i LH1 prstenova) raspoređene su u strukturi RC-LH114-W prema njihovim dobro razlučenim glavnim skupinama (smještenim u Q1 i Q2, respektivno). Slika 5C). Dvije izoprenske jedinice dodijeljene su Q1, a karta gustoće razlučuje svih 10 izoprenskih repova Q2. U strukturi RC-LH116, razlučene su tri kelirane UQ10 molekule (Q1 do Q3, slika 5D), a sve molekule imaju jasnu gustoću kroz cijeli rep (slika 5, D do G). U dvjema strukturama, položaji kinonskih glavnih skupina Q1 i Q2 imaju izvrsnu konzistentnost (slika S12F) i međusobno djeluju samo s RC. Q1 se nalazi na ulazu u W jaz RC-LH114-W (slika 1G i 5, C, D i E), a Q2 se nalazi blizu mjesta vezanja QB (slika 5, C, D) i F). Konzervirani ostaci L-Trp143 i L-Trp269 vrlo su blizu Q1 i Q2 i pružaju potencijalne π-stacking interakcije (slika 5, E i F te slika S12). L-Gln88, 3,0 Å od distalnog kisika Q1, osigurava jaku vodikovu vezu (slika 5E); ovaj ostatak je konzerviran u svim RC osim najudaljenijeg odnosa (slika S13). L-Ser91 je konzervativno supstituiran s Thr u većini drugih RC-ova (slika S13), udaljen je 3,8 Å od metilnog kisika Q1 i može osigurati slabe vodikove veze (slika 5E). Čini se da Q3 nema specifičnu interakciju, ali se nalazi u hidrofobnom području između RC-M podjedinice i LH1-α podjedinice 5 do 6 (slika 5, D i G). Q1, Q2 i Q3 ili obližnji kelirani kinoni također su razlučeni u Tch. Gentle, Trv. Strain 970 i Blc. Struktura šarenice (9, 10, 12) ukazuje na konzervirano pomoćno mjesto vezanja kinona u RC-LH1 kompleksu (slika S12G). Pet razgrađenih UQ-ova u RC-LH116 dobro se slažu s 5,8±0,7 svakog kompleksa određenim visokoučinkovitom tekućinskom kromatografijom (HPLC), dok su tri razgrađena UQ-a u RC-LH114-W niža od Izmjerena vrijednost od 6,2±0,3 (slika S14) ukazuje na to da u strukturi postoje nerazriješene UQ molekule.
Pseudosimetrični L i M polipeptidi sadrže pet TMH i tvore heterodimer koji kombinira jedan BChl dimer, dva BChl monomera, dva bakteriofagna (BPh) monomera i jednu ne-hemsku željeznu skupinu te jednu ili dvije UQ10 molekule. Zbog prisutnosti vodikovih veza na terminalnoj ketonskoj skupini i njezine poznate akumulacije u Rps, karotenoidi su ugrađeni u M-podjedinicu, koja se naziva cis-3,4-dehidroorhodopin. Vrste (25). Domena vanjske membrane RC-H usidrena je na membranu jednim TMH. Ukupna RC struktura slična je tropodjedinici RC srodnih vrsta (kao što je Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makrocikli BChl i BPh, karotenoidni lanac i ne-hemsko željezo preklapaju se unutar raspona razlučivosti ovih struktura, kao i glavna skupina UQ10 na QA mjestu i QB kinon na RC-LH116 (slika S15).
Dostupnost dviju RC struktura s različitim stopama zauzetosti QB mjesta pruža novu priliku za ispitivanje konzistentnih konformacijskih promjena koje prate vezanje QB kinona. U RC-LH116 kompleksu, QB kinon se nalazi u potpuno vezanom "proksimalnom" položaju (26), ali odvajanje RC-LH114-W nema QB kinona. U RC-LH114-W nema QB kinona, što je iznenađujuće jer je kompleks aktivan, više nego RC-LH116 kompleks sa strukturno razdvojenim QB kinonom. Iako dva LH1 prstena keliraju oko šest kinona, pet ih je strukturno razdvojeno u zatvorenom RC-LH116 prstenu, dok su samo tri strukturno ograničena u otvorenom RC-LH114-W prstenu. Ovaj povećani strukturni poremećaj može odražavati bržu zamjenu QB mjesta RC-LH114-W, bržu kinetiku kinona u kompleksu i povećanu vjerojatnost prelaska LH1 petlje. Pretpostavljamo da bi nedostatak UQ-a na RC QB mjestu RC-LH114-W mogao biti rezultat složenijeg i aktivnijeg kompleksa, a QB mjesto RC-LH114-W je odmah zamrznuto u UQ prometu. Specifična faza (ulaz na QB mjesto je zatvoren) odražava konformaciju ove aktivnosti.
Bez QB-a, dolazi do popratne rotacije L-Phe217 u položaj koji nije kompatibilan s vezanjem UQ10, jer će uzrokovati prostorni sudar s prvom izoprenskom jedinicom repa (Slika 6A). Osim toga, očite su glavne konformacijske promjene, posebno helix de (kratka spirala u petlji između TMH D i E) gdje se L-Phe217 pomiče u džep za vezanje QB-a i rotacija L-Tyr223 (Slika 6A) kako bi se prekinula vodikova veza s M-Asp45 okvirom i zatvorio ulaz mjesta vezanja QB-a (Slika 6B). Helix de se okreće u svojoj bazi, Cα L-Ser209 se pomiče za 0,33 Å, dok se L-Val221Cα pomiče za 3,52 Å. Nema uočljivih promjena u TMH D i E, koje se mogu preklopiti u obje strukture (Slika 6A). Koliko znamo, ovo je prva struktura u prirodnom RC-u koja zatvara QB mjesto. Usporedba s potpunom (QB-vezanom) strukturom pokazuje da je prije redukcije kinona potrebna konformacijska promjena kako bi ušao u kinon. L-Phe217 rotira kako bi formirao π-interakciju slaganja s glavnom skupinom kinona, a spirala se pomiče prema van, omogućujući kosturu L-Gly222 i bočnom lancu L-Tyr223 da formiraju mrežu vodikovih veza sa stabilnom strukturom vodikovih veza (slika 6, A i C).
(A) Preklapajući crtež holograma (L lanac, narančasta/M lanac, magenta) i apo (siva) strukture, u kojem su ključni ostaci prikazani u obliku štapićastog prikaza. UQ10 je predstavljen žutom trakom. Isprekidana linija označava vodikove veze formirane u cijeloj strukturi. (B i C) Površinski prikaz apolipoproteina i cijele prstenaste strukture, s istaknutim kisikom bočnog lanca L-Phe217 u plavom i L-Tyr223 u crvenom. L podjedinica je narančasta; M i H podjedinice nisu obojene. (D i E) Apolipoprotein (D) i cijela (E) RC QB mjesta [obojena prema (A)] i Thermophilus thermophilus PSII (zelena, plava s plastičnim kinonom; PDB ID: 3WU2) Poravnanje (58).
Neočekivano, iako je dostupno nekoliko struktura RC-ova s ​​nedostatkom QB-a bez LH1, konformacijske promjene uočene u ovoj studiji nisu prethodno objavljene. To uključuje strukturu osiromašenog QB-a iz Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) i Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), a sve su gotovo iste kao i njihova ukupna QB struktura. Detaljnim pregledom 3PRC otkriveno je da se molekule deterdženta LDAO (lauril dimetil amin oksid) vežu na ulazu u QB poziciju, što može spriječiti preuređenje u zatvorenu konformaciju. Iako se LDAO ne razgrađuje na istoj poziciji u 1EYS ili 1OGV, ovi RC-ovi su pripremljeni korištenjem istog deterdženta i stoga mogu proizvesti isti učinak. Kristalna struktura Rba. Čini se da i Sphaeroides RC kokristaliziran s citokromom c2 (PDB ID: 1L9B) ima zatvoreno QB mjesto. Međutim, u ovom slučaju, N-terminalna regija RC-M polipeptida (koja interagira s QB mjestom vezanja putem H veze Tyr ostatka na Q heliksu) usvaja neprirodnu konformaciju, a QB konformacijska promjena nije dalje istražena (30). Ono što je utješno jest da nismo vidjeli ovu vrstu deformacije M polipeptida u strukturi RC-LH114-W, koja je gotovo ista kao N-terminalna regija RC-LH116 RC. Također treba napomenuti da su nakon uklanjanja LH1 antene na bazi deterdženta, apolipoproteinski RC-ovi u PDB-u razdvojeni, što je eliminiralo unutarnje kinonske bazene i lipide u praznini između RC i unutarnje površine okolnog LH1 prstena (31, 32). RC ostaje funkcionalan jer zadržava sve kofaktore, osim razgradivog QB kinona, koji je manje stabilan i često se gubi tijekom procesa pripreme (33). Osim toga, poznato je da uklanjanje LH1 i prirodnih cikličkih lipida iz RC može utjecati na funkcije, poput skraćenog životnog vijeka P+QB-stanja odvojenog nabojem (31, 34, 35). Stoga nagađamo da postojanje lokalnog LH1 prstena koji okružuje RC može održavati „zatvoreno“ QB mjesto, čime se čuva lokalna okolina u blizini QB-a.
Iako apolipoprotein (bez QB kinona) i potpuna struktura predstavljaju samo dva snimka prometa QB mjesta, a ne niz događaja, postoje indikacije da se vezanje može ograničiti kako bi se spriječilo ponovno vezanje hidrokinonom kako bi se inhibirala inhibicija supstrata. Interakcija kinolola i kinona u blizini QB mjesta apolipoproteina može biti različita, što dovodi do njegovog odbacivanja od strane RC-a. Odavno se pretpostavlja da konformacijske promjene igraju ulogu u vezanju i redukciji kinona. Sposobnost smrznutih RC-a da reduciraju kinone nakon adaptacije na tamu je smanjena (36); rendgenska kristalografija pokazuje da je ovo oštećenje posljedica QB kinona koji su zarobljeni u "distalnoj" konformaciji oko 4,5 Å od aktivnog proksimalnog položaja (26, 37). Predlažemo da je ova distalna konformacija vezanja snimka međustanja između apolipoproteina i pune prstenaste strukture, koja slijedi nakon početne interakcije s kinonom i otvaranja QB mjesta.
Tip II RC pronađen u PSII kompleksu određenih fototrofnih bakterija i cijanobakterija, algi i biljaka ima strukturnu i funkcionalnu konzervaciju (38). Strukturno poravnanje prikazano na slici 6 (D i E) naglašava sličnost između PSII RC-ova i QB mjesta bakterijskog RC kompleksa. Ova usporedba dugo je bila model za proučavanje blisko povezanih sustava vezanja i redukcije kinona. Prethodne publikacije sugerirale su da su konformacijske promjene popraćene PSII redukcijom kinona (39, 40). Stoga, s obzirom na evolucijsku konzervaciju RC-a, ovaj prethodno neuočeni mehanizam vezanja može biti primjenjiv i na QB mjesto PSII RC-a u oksigeniranim fototrofnim biljkama.
Sojevi Rps ΔpufW (neoznačena pufW delecija) i PufW-His (C-terminalni 10x His-označeni protein-W eksprimiran iz prirodnog pufW lokusa). palustris CGA009 opisan je u našem prethodnom radu (16). Ovi sojevi i izogeni roditelj divljeg tipa izolirani su iz zamrzivača nanošenjem malog broja stanica na PYE (svaka 5 g litar -1) (pohranjena u LB na -80 °C, koja sadrži 50% (w/v) glicerolnog) proteina, ekstrakta kvasca i sukcinata) agara [1,5% (w/v)]. Ploča je inkubirana preko noći u mraku na sobnoj temperaturi u anaerobnim uvjetima, a zatim osvijetljena bijelim svjetlom (~50 μmolm-2 s-1) koje su osiguravale OSRAM 116-W halogene žarulje (RS Components, UK) tijekom 3 do 5 dana dok se nije pojavila jedna kolonija. Jedna kolonija korištena je za inokulaciju 10 ml M22+ medija (41) nadopunjenog s 0,1% (w/v) kazeaminokiselina (u daljnjem tekstu M22). Kultura je uzgajana u uvjetima niskog kisika u mraku na 34°C uz tresenje pri 180 rpm tijekom 48 sati, a zatim je 70 ml kulture inokulirano pod istim uvjetima tijekom 24 sata. Poluaerobna kultura volumena 1 ml korištena je za inokulaciju 30 ml M22 medija u univerzalnoj prozirnoj staklenoj boci s navojnim čepom od 30 ml i ozračena uz miješanje (~50μmolm-2 s-1) tijekom 48 sati sterilnom magnetskom miješalicom. Zatim je 30 ml kulture inokulirano s oko 1 litrom kulture pod istim uvjetima, koja je potom korištena za inokulaciju oko 9 litara kulture osvijetljene pri ~200 μmolm-2 s-1 tijekom 72 sata. Stanice su sakupljene centrifugiranjem na 7132 RCF tijekom 30 minuta, resuspendirane u ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) i pohranjene na -20°C do potrebe.
Nakon odmrzavanja, resuspendiranim stanicama dodajte nekoliko kristala deoksiribonukleaze I (Merck, UK), lizozima (Merck, UK) i dvije tablete inhibitora proteaze holoenzima Roche (Merck, UK). U francuskoj tlačnoj ćeliji od 20 000 psi (Aminco, SAD), stanice su razorene 8 do 12 puta. Nakon uklanjanja nerazbijenih stanica i netopljivog otpada centrifugiranjem pri 18 500 RCF tijekom 15 minuta na 4 °C, membrana je istaložena iz pigmentiranog lizata centrifugiranjem pri 113 000 RCF tijekom 2 sata na 43 000 °C. Odbacite topljivu frakciju i resuspendirajte obojenu membranu u 100 do 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) te homogenizirajte dok ne nestanu vidljivi agregati. Suspendirana membrana inkubirana je u 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, SAD) koji sadrži 2% (w/v) β-DDM tijekom 1 sata u mraku na 4°C uz lagano miješanje. Zatim je centrifugirana na 70°C kako bi se otopilo 150 000 RCF na 4°C tijekom 1 sata radi uklanjanja preostalih netopljivih tvari.
Solubilizirajuća membrana iz soja ΔpufW nanesena je na 50 ml DEAE Sepharose ionsko-izmjenjivačku kolonu s tri volumena kolone (CV) pufera za vezanje [20 mM tris-HCl (pH 8,0) koji sadrži 0,03% (w/v) β-DDM]. Kolona se ispere s dva CV pufera za vezanje, a zatim s dva pufera za vezanje koji sadrže 50 mM NaCl. RC-LH116 kompleks eluiran je linearnim gradijentom od 150 do 300 mM NaCl (u puferu za vezanje) na 1,75 CV, a preostali kompleks za vezanje eluiran je puferom za vezanje koji sadrži 300 mM NaCl na 0,5 CV. Prikupi se apsorpcijski spektar između 250 i 1000 nm, frakcija s omjerom apsorbancije (A880/A280) većim od 1 održava se na 880 do 280 nm, dva puta se razrijedi u puferu za vezanje i ponovno se koristi isti postupak na DEAE koloni prilikom pročišćavanja. Razrijedite frakcije s omjerima A880/A280 većim od 1,7 i omjerima A880/A805 većim od 3,0, provedite treći krug ionske izmjene i zadržite frakcije s omjerima A880/A280 većim od 2,2 i omjerima A880/A805 većim od 5,0. Djelomično pročišćeni kompleks koncentriran je na ~2 ml u centrifugalnom filteru Amicon 100 000 molekularne težine (MWCO) (Merck, UK) i nanesen na kolonu za isključivanje po veličini Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, SAD) koja sadrži 200 mM NaCl pufer, a zatim eluiran u istom puferu pri 1,5 CV. Prikupite apsorpcijske spektre frakcije isključivanja veličine i koncentrirajte apsorpcijske spektre s omjerima A880/A280 većim od 2,4 i omjerima A880/A805 većim od 5,8 do 100 A880 te ih odmah upotrijebite za pripremu ili pohranu krio-TEM mreže. Čuvajte na -80 °C dok ne budu potrebni.
Solubilizirajuća membrana iz soja PufW-His nanesena je na 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose kolonu (20 mM tris-HCl (pH 8,0) koja sadrži 200 mM NaCl i 0,03% (w/w)) u IMAC puferu (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolona je isprana s pet CV IMAC pufera, a zatim s pet CV IMAC pufera koji sadrži 10 mM histidina. Jezgreni kompleks eluiran je iz kolone s pet IMAC pufera koji sadrže 100 mM histidina. Frakcija koja sadrži RC-LH114-W kompleks koncentrirana je na ~10 ml u spremniku s miješalicom opremljenom Amicon 100 000 MWCO filterom (Merck, UK), razrijeđena 20 puta s puferom za vezanje, a zatim dodana u 25 ml DEAE Sepharose kolone, unaprijed se koriste četiri CV vezana na pufer. Kolona se ispere s četiri CV pufera za vezanje, zatim se kompleks eluira na osam CV-a na linearnom gradijentu od 0 do 100 mM NaCl (u puferu za vezanje), a preostala četiri CV-a sadrže 100 mM pufer za vezanje. Preostali kompleksi eluirani na natrijevom kloridu u kombinaciji s omjerom A880/A280 većim od 2,4 i omjerom A880/A805 većim od 4,6, koncentrirani su na ~2 ml u centrifugalnom filteru Amicon 100 000 MWCO i napunjeni s 1,5 CV IMAC-a unaprijed uravnoteženog puferom Superdex 200 16/600 kolone za isključivanje po veličini, a zatim eluirani u istom puferu preko 1,5 CV. Prikupiti apsorpcijske spektre frakcija isključivanja veličine i koncentrirati apsorpcijske spektre s omjerima A880/A280 iznad 2,1 i omjerima A880/A805 iznad 4,6 do 100 A880, koji se odmah koristiti za pripremu smrznute TEM mreže ili pohraniti na -80°C do potrebe.
Za pripremu TEM mreža za niske temperature korišten je Leica EM GP uranjajući zamrzivač. Kompleks je razrijeđen u IMAC puferu na A880 od 50, a zatim je 5 μl naneseno na novoizbijeljenu QUANTIFOIL 1.2/1.3 bakrenu mrežicu obloženu ugljikom (Agar Scientific, UK). Mrežu je potrebno inkubirati na 20°C i 60% relativne vlažnosti tijekom 30 sekundi, zatim je osušiti upijajućim papirom tijekom 3 sekunde, a zatim ugasiti u tekućem etanu na -176°C.
Podaci RC-LH114-W kompleksa snimljeni su na eBIC-u (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) s Titan Krios mikroskopom, koji radi na ubrzavajućem naponu od 300 kV, s nominalnim povećanjem od 130 000× i energijom od - Odaberite razmak od 20 eV. Za snimanje slika u načinu brojanja korišten je Gatan 968 GIF Quantum s K2 detektorom vrhova. Kalibrirana veličina piksela je 1,048 Å, a brzina doze je 3,83 e-Å-2s-1. Film je prikupljen za 11 sekundi i podijeljen na 40 dijelova. Koristi se područje obloženo ugljikom za ponovno fokusiranje mikroskopa, a zatim su snimljena tri filma po rupi. Ukupno je prikupljeno 3130 filmova, s vrijednostima defokusiranja između -1 i -3 μm.
Podaci za RC-LH116 kompleks prikupljeni su istim mikroskopom u Asterbury Biostructure Laboratoryju (Sveučilište u Leedsu, UK). Podaci su prikupljeni u načinu brojanja s povećanjem od 130 k, a veličina piksela kalibrirana je na 1,065 Å s dozom od 4,6 e-Å-2s-1. Film je snimljen u trajanju od 12 sekundi i podijeljen u 48 dijelova. Ukupno je prikupljeno 3359 filmova, s vrijednostima defokusiranja između -1 i -3 μm.
Sva obrada podataka izvodi se u Relion 3.0 cjevovodu (42). Koristite Motioncorr 2 (43) za korekciju gibanja snopa ponderiranjem doze, a zatim koristite CTFFIND 4.1 (44) za određivanje parametra CTF (funkcija prijenosa kontrasta). Tipične fotomikrografije nakon ovih početnih faza obrade prikazane su na slici 2. S16. Predložak automatskog odabira generira se ručnim odabirom oko 250 piksela od 1000 čestica u okviru od 250 piksela i bez referentne dvodimenzionalne (2D) klasifikacije, čime se odbacuju one klasifikacije koje zadovoljavaju kontaminaciju uzorka ili nemaju uočljive karakteristike. Zatim je izvršen automatski odabir na svim mikrofotografijama, a RC-LH114-W je imao 849.359 čestica, a RC-LH116 kompleks 476.547 čestica. Sve odabrane čestice prošle su dva kruga nereferentne 2D klasifikacije, i nakon svakog ciklusa, čestice koje zadovoljavaju uvjete područja ugljika, kontaminacije uzorka, bez očitih značajki ili čestica koje se snažno preklapaju odbacuju se, što je rezultiralo sa 772.033 (90,9%) i 359.678 (75,5%) čestica korištenih za 3D klasifikaciju RC-LH114-W i RC-LH116. Početni 3D referentni model generiran je korištenjem stohastičke metode gradijentnog spusta. Koristeći početni model kao referencu, odabrane čestice su klasificirane u četiri kategorije u 3D. Koristeći model u ovoj kategoriji kao referencu, izvršite 3D pročišćavanje čestica u najvećoj kategoriji, zatim upotrijebite početni niskopropusni filtar od 15 Å za pokrivanje područja otapala, dodajte 6 piksela mekih rubova i naknadno obradite piksele kako biste ispravili prijenosnu funkciju modulacije Gatan K2 vrha gornjeg detektora. Za skup podataka RC-LH114-W, ovaj početni model je modificiran uklanjanjem jake gustoće na rubovima maske (odvojene od gustoće jezgrenog kompleksa u UCSF Chimera). Rezultirajući modeli (rezolucije RC-LH114-W i RC-LH116 su 3,91 odnosno 4,16 Å) koriste se kao referenca za drugi krug 3D klasifikacije. Korištene čestice su grupirane u početnu 3D klasu i ne sadrže jaku korelaciju sa susjedstvom. Preklapanje ili nedostatak očitih strukturnih značajki. Nakon drugog kruga 3D klasifikacije, odabrana je kategorija s najvećom rezolucijom [Za RC-LH114-W, jedna kategorija je 377.703 čestice (44,5%), za RC-LH116 postoje dvije kategorije, ukupno 260.752 čestice (54,7%), gdje su iste samo kada su poravnate nakon početne rotacije s malom razlikom]. Odabrane čestice se ponovno ekstrahiraju u kutiji od 400 piksela i pročišćavaju 3D pročišćavanjem. Maska otapala generira se korištenjem početnog niskopropusnog filtera od 15 Å, proširenja mape od 3 piksela i meke maske od 3 piksela. Korištenjem pročišćavanja CTF-a po čestici, korekcije kretanja po čestici i drugog kruga pročišćavanja CTF-a po čestici, 3D pročišćavanje, maskiranje otapalom i naknadna obrada provode se nakon svakog koraka kako bi se dodatno pročistila rezultirajuća tekstura. Korištenjem granične vrijednosti FSC-a (Fourierov koeficijent korelacije ljuske) od 0,143, rezolucije konačnih modela RC-LH114-W i RC-LH116 su 2,65 odnosno 2,80 Å. FSC krivulja konačnog modela prikazana je na slici 2. S17.
Sve proteinske sekvence preuzete su s UniProtKB-a: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) korišten je za konstrukciju homolognog modela RC-a, koji sadrži proteinske sekvence RC-L, RC-M i RC-H, a kristalna struktura Rba. sphaeroides RC korištena je kao predložak (PDB ID: 5LSE) (46). Koristite alat „fit map“ u UCSF Chimeri kako biste prilagodili generirani model mapi (47), poboljšali strukturu proteina i dodali kofaktor [4×BChl a (naziv ostatka u biblioteci monomera = BCL), 2×BPh a (BPH), jednu ili dvije vrste UQ10 (U10), jedno ne-hemsko željezo (Fe) i jedan 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] pomoću Coota (48). Budući da QAK nije dostupan u biblioteci monomera, parametriziran je pomoću alata eLBOW u PHENIX-u (49).
Zatim je konstruirana LH1 podjedinica. U početku je alat za automatsku konstrukciju u PHENIX-u (49) korišten za automatsku konstrukciju dijela LH1 sekvence koristeći mapu i LH1-α i LH1-β proteinske sekvence kao ulaz. Odaberite najpotpuniju LH1 podjedinicu, izdvojite je i učitajte u Coot, ručno dodajte nedostajuću sekvencu i ručno pročistite cijelu strukturu prije dodavanja dva BCl a (BCL) i spiriloksantina (CRT) [prema relevantnim Rps gustoći LH1 kompleksa i poznatom sadržaju karotenoida. Vrsta (17)]. Kopirajte cijelu LH1 podjedinicu i upotrijebite UCSF Chimera "Docking Map Tool" za pristajanje u susjedno područje gustoće LH1 koje nije model, a zatim ga pročistite u Cootu; ponavljajte postupak dok se ne modeliraju sve LH1 podjedinice. Za strukturu RC-LH114-W, izdvajanjem nedodijeljene gustoće u Cootu, protein se segmentira od preostalih neproteinskih komponenti na USCF Chimera mapi, a alat Autobuild se koristi za uspostavljanje početnog modela i modeliranja preostalih podjedinica (protein-W). U PHENIX-u (49). Dodajte sve nedostajuće sekvence rezultirajućem modelu u Cootu (48), a zatim ručno pročistite cijelu podjedinicu. Preostala nedodijeljena gustoća odgovara kombinaciji lipida (PDB monomerna biblioteka ID CDL = CDL, POPC = 6PL i POPG = PGT), β-DDM deterdženta (LMT) i UQ10 molekula (U10). Koristite PHENIX optimizaciju (49) i ručnu optimizaciju u Cootu (48) za usavršavanje cijelog početnog modela dok se statistika modela i vizualna kvaliteta prilagođavanja ne mogu dalje poboljšati. Konačno, koristite LocScale (50) za izoštravanje lokalne mape, a zatim izvedite nekoliko drugih ciklusa modeliranja nedodijeljene gustoće te automatske i ručne optimizacije.
Odgovarajući peptidi, kofaktori i ostali lipidi i kinoni usidreni unutar njihovih odgovarajućih gustoća prikazani su na slikama 1 i 2. S18 do S23. Statističke informacije konačnog modela prikazane su u tablici S1.
Osim ako nije drugačije navedeno, UV/Vis/NIR apsorpcijski spektri su prikupljeni na spektrofotometru Cary60 (Agilent, SAD) u intervalima od 1 nm od 250 nm do 1000 nm i vremenom integracije od 0,1 s.
Uzorak razrijediti u kvarcnoj kiveti s putanjom od 2 mm do A880 od 1 i prikupiti apsorpcijski spektar između 400 i 1000 nm. Kružni dikroični spektri prikupljeni su na spektropolarimetru Jasco 810 (Jasco, Japan) u intervalima od 1 nm između 400 nm i 950 nm pri brzini skeniranja od 20 nm min-1.
Molarni koeficijent ekstinkcije određuje se razrjeđivanjem jezgrenog kompleksa na A880 od približno 50. Razrijedite volumen od 10 μl u 990 μl pufera za vezanje ili metanola i odmah prikupite apsorpcijski spektar kako biste smanjili razgradnju BChl. Sadržaj BChl svakog uzorka metanola izračunat je koeficijentom ekstinkcije na 771 nm od 54,8 mM-1 cm-1, a koeficijent ekstinkcije određen je (51). Izmjerenu koncentraciju BChl podijelite s 32 (RC-LH114-W) ili 36 (RC-LH116) kako biste odredili koncentraciju jezgrenog kompleksa, koja se zatim koristi za određivanje apsorpcijskog spektra istog uzorka sakupljenog u puferu. Koeficijent ekstinkcije. paralelno. Za svaki uzorak provedena su tri ponovljena mjerenja, a za izračun je korištena prosječna apsorbancija maksimuma BChl Qy. Koeficijent ekstinkcije RC-LH114-W izmjeren na 878 nm iznosi 3280±140 mM-1 cm-1, dok je koeficijent ekstinkcije RC-LH116 izmjeren na 880 nm 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 je kvantificiran prema metodi u (52). Ukratko, HPLC reverzne faze (RP-HPLC) proveden je korištenjem Agilent 1200 HPLC sustava. Otopite oko 0,02 nmol RC-LH116 ili RC-LH114-W u 50 μl 50:50 metanol:kloroforma koji sadrži 0,02% (w/v) željeznog klorida i ubrizgajte prethodno uravnoteženu Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm otopinu u 1 ml-1 min-1 na 40°C u HPLC otapalu (80:20 metanol:2-propanol) na kolonu ×25 cm. Provedite izokratsku eluciju u HPLC otapalu kako biste pratili apsorbanciju na 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidi) i 780 nm (BChl) tijekom 1 sata. Integriran je vrh na kromatogramu na 275 nm u 25,5 minuta, koji nije sadržavao nikakve druge detektabilne spojeve. Integrirana površina koristi se za izračun molarne količine ekstrahiranog UQ10 s obzirom na kalibracijsku krivulju izračunatu injekcijom čistih standarda od 0 do 5,8 nmol (slika S14). Svaki uzorak analiziran je u tri ponavljanja, a prijavljena pogreška odgovara standardnoj devijaciji prosjeka.
Otopina koja sadrži RC-LH1 kompleks s maksimalnom Qy apsorpcijom od 0,1 pripremljena je s 30 μM reduciranog citokroma c2 iz konjskog srca (Merck, UK) i 0 do 50 μMUQ2 (Merck, UK). Pripremljena su tri uzorka od 1 ml pri svakoj koncentraciji UQ2 i inkubirana preko noći u mraku na 4°C kako bi se osigurala potpuna prilagodba mraku prije mjerenja. Otopina je stavljena u modularni spektrofotometar OLIS RSM1000 opremljen rešetkom plamena od 300 nm/500 linija, ulaznim prorezima od 1,24 mm, srednjim prorezima od 0,12 mm i izlaznim prorezima od 0,6 mm. Na ulazu fotocijevi za uzorak i referentne fotomultiplikacijske cijevi postavljen je filtar duljine 600 nm kako bi se isključila pobudna svjetlost. Apsorbancija je praćena na 550 nm s vremenom integracije od 0,15 s. Pobudna svjetlost emitira se iz 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) kroz optički kabel intenziteta 90% putem DC2200 kontrolera (Thorlabs Ltd., UK) i emitira se prema izvoru svjetlosti pod kutom od 90°. Mjerna zraka je usmjerena nasuprot zrcalu kako bi se vratila svjetlost koju uzorak u početku nije apsorbirao. Pratite apsorbanciju 10 s prije osvjetljenja od 50 s. Zatim je apsorbancija dodatno praćena tijekom 60 s u mraku kako bi se procijenio stupanj u kojem kinolol spontano reducira citokrom c23+ (vidi sliku S8 za sirove podatke).
Podaci su obrađeni prilagođavanjem linearne početne brzine unutar 0,5 do 10 s (ovisno o koncentraciji UQ2) i usrednjavanjem brzina sva tri uzorka pri svakoj koncentraciji UQ2. Koncentracija RC-LH1 izračunata odgovarajućim koeficijentom ekstinkcije korištena je za pretvaranje brzine u katalitičku učinkovitost, prikazanu u Origin Pro 2019 (OriginLab, SAD), te prilagođenu Michaelis-Mentenovom modelu za određivanje prividnih vrijednosti Km i Kcat.
Za mjerenja tranzijentne apsorpcije, uzorak RC-LH1 razrijeđen je na ~2μM u IMAC puferu koji sadrži 50 mM natrijevog askorbata (Merck, SAD) i 0,4 mM terbutina (Merck, SAD). Askorbinska kiselina koristi se kao žrtveni donor elektrona, a tert-butaklofen kao inhibitor QB-a kako bi se osiguralo da glavni RC donor ostane reduciran (tj. da se ne fotooksidira) tijekom cijelog procesa mjerenja. Otprilike 3 ml uzorka dodaje se u prilagođenu rotirajuću ćeliju (promjera oko 0,1 m, 350 okretaja u minuti) s duljinom optičkog puta od 2 mm kako bi se osiguralo da uzorak u laserskom putu ima dovoljno vremena za adaptaciju na tamu između pobudnih impulsa. Koristite laserske impulse od ~100 fs za pojačavanje Ti:Sapphire laserskog sustava (Spectra Physics, SAD) kako biste pobudili uzorak na 880 nm pri brzini ponavljanja od 1 kHz (20 nJ za NIR ili 100 nJ za Vis). Prije prikupljanja podataka, uzorak izložite pobudnoj svjetlosti oko 30 minuta. Izloženost će uzrokovati inaktivaciju QA (moguće smanjenje QA jednom ili dvaput). No, imajte na umu da je ovaj proces reverzibilan jer će se nakon dugog razdoblja adaptacije na tamu, RC polako vratiti QA aktivnosti. Helios spektrometar (Ultrafast Systems, SAD) korišten je za mjerenje prolaznih spektara s vremenom kašnjenja od -10 do 7000 ps. Koristite softver Surface Xplorer (Ultrafast Systems, SAD) za razgrupiranje skupova podataka, a zatim spajanje i standardizaciju. Koristite softverski paket CarpetView (Light Conversion Ltd., Litva) za korištenje kombiniranog skupa podataka za dobivanje diferencijalnih spektara povezanih s raspadom ili koristite funkciju koja konvolvira više eksponenata s odzivom instrumenta kako bi se prilagodila spektralna evolucija jedne valne duljine u Origin (OriginLab, SAD).
Kao što je gore spomenuto (53), pripremljen je fotosintetski film koji sadrži LH1 kompleks kojem nedostaju i RC i periferna LH2 antena. Membrana je razrijeđena u 20 mM tris (pH 8,0) i zatim stavljena u kvarcnu kivetu s optičkim putem od 2 mm. Za pobuđivanje uzorka na 540 nm korišten je laserski puls od 30 nJ s vremenom odgode od -10 do 7000 ps. Obradite skup podataka kao što je opisano za uzorak Rps.pal.
Membrana je peletirana centrifugiranjem pri 150 000 RCF tijekom 2 sata na 4°C, a zatim je njezina apsorbancija na 880 nm resuspendirana u 20 mM tris-HCl (pH 8,0) i 200 mM NaCl. Otopite membranu polaganim miješanjem u 2% (w/v) β-DDM tijekom 1 sata u mraku na 4°C. Uzorak je razrijeđen u 100 mM trietilamonijevom karbonatu (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) do koncentracije proteina od 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad analiza). Daljnja obrada provedena je prema prethodno objavljenoj metodi (54), počevši s razrjeđivanjem 50 μg proteina u ukupno 50 μl TEAB-a koji sadrži 1% (w/v) natrijevog laurata (Merck, UK). Nakon sonikacije tijekom 60 sekundi, reduciran je s 5 mM tris(2-karboksietil)fosfina (Merck, UK) na 37°C tijekom 30 minuta. Za S-alkilaciju, uzorak se inkubira s 10 mM metil S-metiltiometansulfonatom (Merck, UK) i dodaje se iz 200 mM izopropanolne osnovne otopine tijekom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Proteolitička digestija provedena je dodavanjem 2 μg smjese tripsina/endoproteinaze Lys-C (Promega UK) i inkubirana na 37°C tijekom 3 sata. Lauratni surfaktant ekstrahiran je dodavanjem 50 μl etil acetata i 10 μl 10% (v/v) trifluoroctene kiseline LC kvalitete (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) i vrtloženjem tijekom 60 sekundi. Fazno odvajanje potaknuto je centrifugiranjem na 15 700 RCF tijekom 5 minuta. Prema protokolu proizvođača, za pažljivo aspiriranje i odsoljavanje donje faze koja sadrži peptid korištena je C18 spin kolona (Thermo Fisher Scientific, UK). Nakon sušenja vakuumskim centrifugiranjem, uzorak je otopljen u 0,5% TFA i 3% acetonitrila, a 500 ng je analizirano nanoflow RP kromatografijom spojenom s masenom spektrometrijom korištenjem prethodno detaljno opisanih parametara sustava.
Za identifikaciju i kvantifikaciju proteina koristite MaxQuant v.1.5.3.30 (56) za pretraživanje baze podataka proteoma Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Podaci proteomike masene spektrometrije pohranjeni su u ProteomeXchange Allianceu putem partnerskog repozitorija PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) pod identifikatorom skupa podataka PXD020402.
Za analizu RPLC-om spojenim s masenom spektrometrijom s elektrosprejnom ionizacijom, RC-LH1 kompleks je pripremljen iz divljeg tipa Rps. Korištenjem prethodno objavljene metode (16), koncentracija proteina proizvedena u stanicama palustrisa bila je 2 mg ml-1 u 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl i 0,03% (w/v) β-(Bio-Rad analiza)) DDM. Prema protokolu proizvođača, upotrijebite 2D komplet za pročišćavanje (GE Healthcare, SAD) za ekstrakciju 10 μg proteina metodom taloženja i otopite talog u 20 μl 60% (v/v) mravlje kiseline (FA), 20% (v/v) acetonitrila i 20% (v/v) vode. Pet mikrolitara je analizirano RPLC-om (Dionex RSLC) spojenim s masenom spektrometrijom (Maxis UHR-TOF, Bruker). Za odvajanje na 60°C i 100 μlmin -1 koristite MabPac kolonu 1,2 × 100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK), s gradijentom od 85% (v/v) otapala A [0,1% (v/v) FA i 0,02% (V/v) vodene otopine TFA] do 85% (v/v) otapala B [0,1% (v/v) FA i 0,02% (v/v) u 90% (v/v) acetonitrilu TFA]. Korištenjem standardnog izvora elektrosprej ionizacije i zadanih parametara dulje od 60 minuta, maseni spektrometar postiže 100 do 2750 m/z (omjer mase i naboja). Uz pomoć alata FindPept na portalu bioinformatičkih resursa ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mapirajte maseni spektar na podjedinice kompleksa.
Stanice su uzgajane 72 sata pod 100 ml NF-niskog (10μMm-2 s-1), srednjeg (30μMm-2 s-1) ili jakog (300μMm-2 s-1) svjetla. M22 medij (M22 medij u kojem je amonijev sulfat izostavljen, a natrijev sukcinat zamijenjen natrijevim acetatom) u bočici s navojnim čepom od 100 ml (23). U pet ciklusa od 30 sekundi, staklene kuglice od 0,1 mikrona dodavane su u volumenskom omjeru 1:1 za liziranje stanica i hlađenje na ledu 5 minuta. Netopljiva tvar, nerazbijene stanice i staklene kuglice uklonjene su centrifugiranjem pri 16 000 RCF tijekom 10 minuta u stolnoj mikrocentrifugi. Membrana je odvojena u Ti 70.1 rotoru sa 100.000 RCF u 20 mM tris-HCl (pH 8,0) s gradijentom saharoze 40/15% (w/w) tijekom 10 sati.
Kao što je opisano u našem prethodnom radu, imunodetekcija His oznake na PufW (16). Ukratko, pročišćeni jezgreni kompleks (11,8 nM) ili membrana koja sadrži istu koncentraciju RC (određenu oksidacijom oduzimanjem reduciranog spektra razlike i usklađivanjem opterećenja na obojenom gelu) u 2x SDS puferu za punjenje (Merck, UK) razrijeđenom dva puta. Proteini su odvojeni na replici 12% bis-tris NuPage gela (Thermo Fisher Scientific, UK). Gel je obojen s Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) za punjenje i vizualizaciju RC-L podjedinice. Protein na drugom gelu prenesen je na metanolom aktiviranu poliviniliden fluoridnu (PVDF) membranu (Thermo Fisher Scientific, UK) za imunološki test. PVDF membrana je blokirana u 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 i 5% (w/v) obranom mlijeku u prahu, a zatim inkubirana s primarnim anti-His antitijelom (u puferu za razrjeđivanje antitijela [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl i 0,05% (v/v) Tween-20] u 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, SAD) tijekom 4 sata. Nakon trostrukog ispiranja po 5 minuta u puferu za antitijela, membrana je kombinirana s antimišjim sekundarnim antitijelom iz hren peroksidaze (Sigma-Aldrich, UK) (razrijeđenim 1:10 000 u puferu za antitijela). Inkubirano je kako bi se omogućila detekcija (5 minuta nakon 3 ispiranja u puferu za antitijela) korištenjem WESTAR ETA C 2.0 kemiluminiscentne podloge (Cyanagen, Italija) i Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Crtanjem raspodjele intenziteta svakog obojenog gela ili imunološkog testa, integriranjem površine ispod vrha i izračunavanjem omjera intenziteta RC-L (obojeni gel) i Protein-W (imunotest), u ImageJ (57) obradite sliku. Ovi omjeri su pretvoreni u molarne omjere pretpostavkom da je omjer RC-L i protein-W u čistom uzorku RC-LH114-W bio 1:1 i normalizacijom cijelog skupa podataka u skladu s tim.
Za dodatne materijale za ovaj članak, pogledajte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod uvjetima Creative Commons Attribution licence. Članak dopušta neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju pod uvjetom da je izvorno djelo ispravno citirano.
Napomena: Molimo vas da navedete svoju adresu e-pošte samo kako bi osoba koju preporučite stranici znala da želite da vidi e-poštu i da se ne radi o neželjenoj pošti. Nećemo prikupljati nikakve adrese e-pošte.
Ovo pitanje se koristi za provjeru jeste li posjetitelj i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktura visoke rezolucije kompleksa svjetlosne zamke 1 u reakcijskom centru pruža nove uvide u dinamiku kinona.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktura visoke rezolucije kompleksa svjetlosne zamke 1 u reakcijskom centru pruža nove uvide u dinamiku kinona.
©2021 Američka udruga za napredak znanosti. sva prava pridržana. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.